PKCalpha和PKCepsilon对人内皮细胞NOX4基因表达调节的不同作用.doc

PKC alpha 和 PKC epsilon 对人内皮细胞 NOX4 基因表达调节的不同作用华中科技大学同济医学院同济医院麻醉学教研室（430030）徐卉 陈映红 李会革 田玉科目的：体外循环中白细胞激活和缺血后再灌注可诱发全身炎症反应综合征（SIRS），出现急性血管损伤氧自由基（ROS）的生成和激活参与其发生机制NADPH氧化酶是血管壁中过氧化物产生的主要来源体内激活PKC可诱导NADPH氧化酶活性增加本研究拟探讨PKC 对人血管内皮细胞NADPH氧化酶基因表达的调节作用方法：分别用PKC激活剂佛波醇酯PMA，PKC抑制剂Gö6983处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和由HUVEC衍生的EA.hy926内皮细胞6小时，24小时或48小时用实时定量Real-Time RT-PCR 测定NOX4 mRNA 基因表达分别提取内皮细胞膜蛋白和胞浆蛋白，用western blot 检测PKC表达和转运激活用荧光探针CM-H2DCFDA测定细胞内ROS合成用lucigenin 化学发光法测定细胞内外ROS生成量用siRNA技术敲除细胞内PKC alpha 和epsilon 基因后，再检测NOX4mRNA 在各处理中的表达及氧自由基的生成。

用PKC生理激活剂VEGF处理HUVEC细胞，观察细胞增殖及运用Matrix-gel 检测血管新生实验应用SPSS 8.0 统计学软件进行分析，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析P<0.05为差异有统计学意义结果：用PMA处理HUVEC或EA.hy926 内皮细胞，可双相调节NOX4基因表达，这种调节依赖PKC的膜转运激活PMA处理后6小时，NOX4基因水平下调（p<0.01）；处理48小时后，NOX4 基因水平上调（p<0.01）与此相应，6小时细胞生成的ROS减少（p<0.01），48小时细胞生成的ROS明显增加（p<0.01）PKC抑制剂Gö6983可抑制PMA对NOX4基因表达的调控和对ROS产量的影响（p<0.01）人内皮细胞NOX4 mRNA半衰期约为6小时，PMA处理不影响NOX4 mRNA 的稳定性 在人EA.hy926细胞，PMA 可激活PKC 亚型 alpha 和 epsilon用siRNA 技术敲除内皮细胞的PKC epsilon 亚型后， PMA 6小时处理不再使NOX4 mRNA 基因表达下调（p<0.01）；敲除PKC alpha 亚型后， PMA48小时处理也不再上调 NOX4 mRNA 基因表达，与此相应，ROS生成量明显低于对照组（p<0.01）。

VEGF可激活HUVEC PKC alpha亚型，上调NOX4 mRNA 表达（p<0.01），并促进细09 年会-麻醉学基础研究胞增殖和血管新生结论：PKC化学激活剂PMA或生理激活剂VEGF 均可激活内皮细胞PKC alpha，上调NOX4 mRNA表达，增加ROS生成，并促发内皮细胞增殖和血管新生，是体外循环中引起血管急性损伤的发生机制之一因此选择性抑制或敲除PKC alpha 可视为一种预防或治疗脉管系统氧化应激损伤的新策略。