核酸细胞化学.doc

FeulgenFeulgen 反应反应原理介绍自从 1924 年 Feulgen 等人建立了 DNA-Feulgen 染色方法以来,至今这种方法仍是 DNA 定量测定的主要染色方法之一.Feulgen 染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用 Carnay 氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.自 Feulgen 等发明该显示 DNA 的 Feulgen 反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA 分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基Schiff 试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色也就是说, DNA 经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出 DNA 的分布2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3DNA 是主要的遗传物质，集中于染色体上1924 年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上 DNA 的存在，故称为孚尔根染色法孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时被氧化，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的 N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色利用 1M HCl 、60℃下水解时，可将 DNA 分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖 C-1 位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色细胞中只有 DNA 才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定 DNA 的存在并广泛应用于核及染色体的研究中FeulgenFeulgen 反应步骤反应步骤标本需经固定后方可染色，Carnoy 固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为 6：3：1 比例配制固定后石蜡切片即可尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂减少非特异染色，具体操作如下：1．切片脱蜡入水；2．用 lmol/L HCl 浸洗；3．切片放人预热到 60℃1mol/LHCi 内 6 分钟，(固定的标本为 10～15 分钟．Susa 固定的标本为 18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)；4．入室温 lmol/LHCl 洗；5．蒸馏水洗；6．人 Schiff 液，于室温暗处(或外包黑纸)30～60 分钟；7．人亚硫酸钠水溶液漂洗 3 次，每次 1～2 分钟；亚硫酸钠水溶液配法：10%NaHS03 5ml1mol/L HCl 5ml加蒸馏水至 100ml8．蒸馏水洗；9．脱水、透明、封固。

结果：细胞核内 DNA 染成紫红色对照实验：对照实验：虽然 Feulgen 法是 DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff 试剂也与醛、酮、醇和缩醛磷脂起反应，因此用 Feulgen 法检测 DNA 时必须严格控制盐酸水解的时间和温度为减少假阳性和非特异性染色必须做对照实验可按上述步骤做平行对照实验，仅将第 3 步，即 60℃ lmol/LHCl 水解改为室温 15 分钟，其余与上述步骤相同，结果 DNA 应为 Feulgen 阴性反应Feulgen 反应图大鼠肾小体和肾小管细胞核呈 nigert 阳性反应，含紫红色反应产物FeulgenFeulgen 方法应注意的问题方法应注意的问题对照切片的制做进行 Feulgen 反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果对照切片应不经水解直接放在schiff 剂内，且应为负反应但需要注意的是，对照切片在 schiff 试剂中最多不要超过 1 h (0.5 h 即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使 DNA 水解，从而出现假的正反应固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。

实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于 Feulgen 反应如 Bhampy 固定剂、Helly 固定剂、Flemming 固定剂、OsO4 固定剂、Carnoy 固定剂、zenker 固定剂和 Bouin-Aller 固定剂但在上述固定剂中，以 OsO4 和 Carnoy 效果较好，OsO4(1%或 0.5%)是 Feulgen 反应的理想固定剂，只是因 OsO4 价钱较贵，故一般多采用 Carnoy 固定液在 Feulgen 反应中，不能单独使用 Bouin 定液，因为它是 Feulgen 反应的最坏固定剂，但经 Aller 改进后的 Bouin-Aller 固定液效果却较好水解时间Feulgen 反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱适当的水解时间一般为8~12min但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定Schiff 试剂的作用Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素，就是 schiff 试剂的质量有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。

因此只能选用注明“DNA 染色反应用”的碱性品红才行此外，Schiff 试剂的配制方法也可影响 DNA 的染色反应GiemsaGiemsa 染色法染色法MGG 由 May-Grunwald 染料和 Giemsa 染料组成前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好因此 MGG 染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色2 染液配制I 液的配制：迈格染料 lg甲醇 100ml在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒人烧瓶中，加入其余的甲醇后置入 37℃温箱 4-6 小时，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2 周后使用临用前取上液 40ml，加纯甲醇 20ml 混合用作工作液Ⅱ液的配制：姬氏染粉 0.6g甘油 50ml甲醇 100ml将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨 3-4 小时，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2 周后即可使用磷酸缓冲液配制：1％磷酸氢二钠 20ml，l％磷酸二氢钠 30ml，加蒸馏水至 1000ml，调整 pH 6.4-6.8(用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳)3 染色步骤(1)自然干燥的细胞涂片(预先滴加甲醇固定更好)水平置于染色架上。

2)将 I 液(用缓冲液或蒸馏水 5-10 倍稀释)滴盖涂片上，lO-30 分钟3)倒弃涂片上的 I 液，自来水漂洗干净4)立即滴盖Ⅱ液(用缓冲液或蒸馏水 5-10 倍稀释)在涂片上染色 10-30 分钟5)倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净6)趁湿加盖片或待干后镜检4 染色结果MGG 染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色5MGG 染色特点染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色MGG 染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比 HE 染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG 染色更有帮助苏木精苏木精- -伊红（伊红（HEHE）染色）染色HE 染色是一种以形态为基础,结合应用化学技术对组织、各种细胞进行染色的实验技术,用于研究组织细胞的生理、病理和化学结构.基本原理:去氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色.苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色.伊红 Y 是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料.一般染色组织切片厚度为 3µm 左右,中枢神经系统 6～8µm,肾小球基底膜染色观察时要求 1.5～2µm 标准厚度.染液制备：染液制备：1.苏木精染液(1)称取 0.5g 苏木精、5.0g 铵矾或钾矾和 0.1g 碘酸钠加温溶于 70ml 蒸馏水中；(2)加入 30ml 甘油和 2ml 冰乙酸充分混匀后过滤即成母液；(3)母液可长期保存。

用蒸馏水以 1：20 稀释母液即成工作液工作液也较长时间储存，但每次染色前宜过滤，去除氧化膜；2.伊红染液伊红有醇溶性与水溶性之分将 0.5g 伊红溶于 100ml70%乙醇或蒸馏水即成工作液；染色步骤：染色步骤：1.用 37℃的温 BSS 漂洗 3 次，每次 20s-1min；2.用中性福尔马林固定 30min；3.用蒸馏水漂洗 1 次，再用蒸馏水稀释的苏木精液(1/20)染 10min；4.先用自来水冲洗几次，而后置入 1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色；5.在放入伊红水溶液中染 30s-1min；6.用蒸馏水冲洗，迅速通过丙酮 2 次，每次 3-5min；7.通过 2：1 丙酮/二甲苯 3 次，每次 1-2min；8.通过 1：2 丙酮/二甲苯 3 次，每次 1-2min；9.放入纯二甲苯 5-10min，用光学树脂封片后观察；10.把盖片置载物玻片上，令小盖片细胞面向上，用树胶封存，再覆以较大盖片；结果：结果：原代细胞核染成红色，胞质染成蓝紫色。