sds-page凝胶电泳技术(原版).pptx

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE食品科学 王玲华一、什么是SDS十二烷基硫酸钠 一种阴离子去污剂它在水溶液中以单体 和分子团的混合形式存在SDS的作用破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之 间的非共价键，使蛋白质解聚而改变原有的构 象，保证解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合 而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物二、SDS-PAGE的基本原理（一）蛋白质分子的解聚样品介质和聚丙烯酰胺中加入阴离子去污 剂SDS和强还原剂后，蛋白质分子解聚，与 SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物， 蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分 子量的大小，而蛋白质原有电荷因素可以被 忽略1、SDS阴离子去污剂变性剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构2、强还原剂巯基乙醇（β-mercaptoethanal）二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂蛋白质-SDS复合物的特点： （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本 上是相同的。

（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正 比 （4）所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有 电荷，消除了蛋白质分子间原有电荷差异复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不 再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决 于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分 子量的大小当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间 时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关 系3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L)大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26)低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度 （3） 二硫键是否完全被还原当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能 被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出 相对迁移率和分子量对数的线性关系二）缓冲系统的选择一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的pH 范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可 以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电 泳的速度是非常关键的电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速度要比后者快一倍。

4、尿素系统：适用分子量低于15KD的蛋白样品 5、Tris-甘氨酸系统：使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量（三）凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电 荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶 束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响 分辨率不同分子量范围的蛋白质应选用不同的 凝胶浓度.凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表1样品分子量范围分离胶浓度（%）蛋白质＜10420-30（1-4）×10415-204×（104-105）10-15（1-5）×1055-10＞5×1052-5核酸＜10415-20104-1055-10105-2×1052-2.6三、分离方法1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同还原SDS电泳非还原SDS电泳带有烷基化作用的还原SDS电泳（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同连续电泳不连续电泳（3）根据电泳的形式圆盘电泳垂直电泳平板电泳 水平电泳2、操作要点 （1）制备凝胶 丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（BIS）在催化 剂的作用下聚合过硫酸铵和四甲基乙二胺（化学聚合催化剂） 催化剂 核黄素（光聚合的催化剂不连续电泳使用不同孔径的凝胶，使用不同 的pH和缓冲液。

不连续电泳的凝胶由上至下可分为：(1)样品胶：大孔径凝胶，在pH6.7~6.8的 Tris-HCL中聚合，含有样品2）浓缩胶：除不含样品外，其他与样品 胶相同3）分离胶：小孔径凝胶，在pH8.8~8.9 的Tris-HCL中聚合.（2）电极缓冲液的选择 （3）电泳 加样后，接通电源开始时将电流调至10mA 待样品进入分离胶时，将电流调至20－ 30mA继续电泳，直至溴酚蓝染料到达分离胶 底部上方约1cm时，关闭电源拔掉固定板， 取下玻璃板，取出胶板4）染色和脱色 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白 质样品，浸泡在含0.5%氨基黑10B的7% 醋酸染色体中，或浸泡在含0.1%考马斯 亮蓝的12.5%-50%的三氯醋酸染色液 中进行染色和蛋白质的固定染色1 ～2小时或过夜染色后的凝胶板用蒸 馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到 蛋白质区带清晰3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象指示剂前沿呈现 两边 向上 的曲线形，说明凝胶的不均 匀冷却，中间部分冷却不好2）“皱眉”现象由于垂直电泳槽的装置不合适引起的， 特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部 有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。

3）“拖尾”现象样品溶解不佳引起4）偏斜现象电极放置不平行引起或加样位置偏斜而 引起四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用1、测定分子质量 2、提纯蛋白质 3、检测牛奶中掺杂的豆奶 4、对猪皮水解胶原蛋白的分离 5、发芽糙米中谷蛋白亚基电泳分析。