DNA操作技术课件.ppt

第四章第四章 DNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术学习内容：DNA操作酶操作酶 –核酸酶核酸酶–连接酶连接酶–聚合酶聚合酶–DNADNA修饰酶修饰酶限制性内切酶限制性内切酶–分类和命名分类和命名分类和命名分类和命名–酶切体系、反应条件、结果鉴定酶切体系、反应条件、结果鉴定酶切体系、反应条件、结果鉴定酶切体系、反应条件、结果鉴定–定位酶切位点定位酶切位点定位酶切位点定位酶切位点连接连接DNADNA操作技术操作技术1. DNA操作酶操作酶 核酸酶：剪切、缩短、降解核酸–Bal31–E. coli外切酶III–S1 内切酶–DNase I–RNase H连接酶：连接核酸分子聚合酶：复制修饰酶：增加或去除化学基团拓扑异构酶：引入或去除超螺旋的闭合环状DNADNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶作用：降解 磷酸二酯键分为： 外切酶 内切酶DNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性依赖于Ca2+用途：构建限制酶图谱产生末端缺失突变DNA超螺旋线性化DNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶E. coli外切酶III只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。

DNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶来自于真菌Aspergillus oryzae 的S1内切酶作用于单链DNA或RNApH4.0-4.3,Zn2+用途：用途：分析内元的位置获得平端ds-DNA酶量大时，降解双链DNADNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶来自于牛胰腺的DNase I既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链DNADNA操作技术操作技术1.1 核酸酶RNase H（E. coli）–降解RNA:DNA杂交分子中的RNADNADNA操作技术操作技术1.2 连接酶广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基和5’端磷酸形成磷酸二酯键在DNA复制、修复、以及体外重组过程中起重要作用DNADNA操作技术操作技术1.2 连接酶T4-DNA连接酶 –连接粘性末端、平端–修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口E. coli DNA连接酶–连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成）T4-RNA连接酶DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶依赖DNA的DNA聚合酶不依赖DNA的DNA聚合酶（末端转移酶）依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶DNA聚合酶I–5’-3’聚合酶活性–3’-5’外切酶活性–5’-3’外切酶活性–核酸内切酶活性可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。

DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶Klenow酶–修复限制性内切酶造成的粘端–标记DNA探针–催化cDNA第二条链的合成–末端终止法测序DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶T4 DNA聚合酶–与Klenow酶相似，外切酶活性更高体外诱变反应中效率很高T7 DNA聚合酶–测序酶Taq DNA聚合酶DNADNA操作技术操作技术1.3 聚合酶逆转录酶：将mRNA转录成cDNA–AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）DNA聚合酶活性RNase H活性DNA内切酶活性核酸结合活性–M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸甲基化酶具有完全相同的识别序列。

DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶甲基化酶:– – 大肠杆菌中的甲基化酶 dam甲基化酶 在5'GATC3'的腺嘌呤N6位上引入甲基，可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性 dcm甲基化酶 此酶在序列5‘CCAGC3’或5‘CCTGG3’中间的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶甲基化酶在基因工程中用途 – 许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使免受切割– 如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割 DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶l末端脱氧核苷酰转移酶（TDT）–3’端突出的双链DNA，Mg2+–平端或3‘凹端的低物，Co2+DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶lT4--多核苷酸激酶（T4-PNP）–将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端–放射性标记DNA的5’端–连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化DNADNA操作技术操作技术1.4 DNA修饰酶l碱性磷酸酶（BAP, CIP）–作用于载体的5’端，提高重组效率–作用于外源DNA的5’端，防止自连DNADNA操作技术操作技术1.5 拓扑异构酶在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋在EDTA溶液中也有活性DNADNA操作技术操作技术2 限制性内切酶DNADNA操作技术操作技术2 限制性内切酶Restriction Endonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。

不同来源的DNA具有不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶切图谱在生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事诊断以及基因重组领域起重要作用，并誉为“分子手术刀”DNADNA操作技术操作技术2 限制性内切酶DNADNA操作技术操作技术2.1 限制性内切酶的发现早在二十世纪五十年代发现一些细菌对噬菌体具有免疫性，称为寄主控制的限制限制的出现因为在噬菌体复制合成新的颗粒之前，细菌就产生酶降解噬菌体DNA, 而细菌自身的DNA分子的酶识别位点已被甲基化修饰，这种酶被称为限制性内切酶 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础 DNADNA操作技术操作技术2.2 限制性内切酶分类 限制性核酸内切酶可分为三大类： – I类 –II类* –III类DNADNA操作技术操作技术I 类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

苷酸顺序没有专一性，是随机的代表代表EcoB、、EcoKDNADNA操作技术操作技术(II型)限制性内切酶•能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，，并并在在该该顺序内的固定位置上切割双链顺序内的固定位置上切割双链•II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序(palindrome)，，即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴，，从从这这个个轴轴朝朝二二个方向个方向“读读”都完全相同都完全相同DNADNA操作技术操作技术III型型限制性内切酶限制性内切酶•有专一的识别顺序，但不是对称的有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序回文顺序,在识别顺序旁边几个核在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链苷酸对的固定位置上切割双链DNADNA操作技术操作技术2.3 限制性内切酶的命名原则命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子Pvu I识别CGATCG，Pvu II识别CAGCTG, 都来自于Proteus vulgaris。

HindIII是在Haemophilus influenzae d株中发现的第三种酶DNADNA操作技术操作技术2.3 限制性内切酶的命名原则EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上许多内切酶识别6碱基序列，也有的识别4、5、8核苷酸序列Sau3A来自于Staphylococcus aureus 品系3A，识别GATC也有一些酶识别兼并序列，如HinfI来自于Haemophilus influenzae品系Rf，识别GANTC，N代表A, G, T, CDNADNA操作技术操作技术2.4 限制性内切酶产物钝端（平端）粘性末端 DNADNA操作技术操作技术粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端所以称为粘性末端所以称为粘性末端所以称为粘性末端。

垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“ “读读读读” ”核苷酸顺序核苷酸顺序核苷酸顺序核苷酸顺序都是都是都是都是GAATTCGAATTC或或或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序，这就是回文顺序，这就是回文顺序，这就是回文顺序（（（（palindromepalindrome） _和和和和‘ ‘表示在双链上交错切割的表示在双链上交错切割的表示在双链上交错切割的表示在双链上交错切割的位置，切割后生成位置，切割后生成位置，切割后生成位置，切割后生成5’……G5’……G和和和和AATTC……3’AATTC……3’、、、、3’……CTTAA3’……CTTAA和和和和G……5’G……5’二个二个二个二个DNADNA片段，各有一片段，各有一片段，各有一片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过二酯键以及氢键可通过二酯键以及氢键可通过二酯键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而连接酶的作用而连接酶的作用而“ “粘合粘合粘合粘合” ”。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　DNADNA操作技术操作技术II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端例如割双链，产生平头末端例如EcoRV 的识的识别位置是：别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’3’…… CTA’|TAG …… 5’ 　　切割后形成切割后形成5’…… GAT和和ATC …… 3’、、 3’…… CTA和和TAG …… 5’这种末端同样这种末端同样可以通过可以通过DNA连接酶连接起来连接酶连接起来DNADNA操作技术操作技术2.4 限制性内切酶产物同位酶（同位酶（Isoschizomers））:识别识别序列相同但切点不同的酶序列相同但切点不同的酶HpaII和和MspI都识别都识别5’∙∙∙∙∙∙GGCC∙∙∙∙∙∙3’，如其中有，如其中有5甲基胞甲基胞嘧啶，，则只有只有HpaII能切割同尾酶：识别位点不同，但切出的同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列片段具有相同的末端序列DNADNA操作技术操作技术2.4 限制性内切酶产物限制性内切酶产物同裂酶（同切酶或异源同工酶）：识同裂酶（同切酶或异源同工酶）：识别位点与切割位点均相同，其差别只别位点与切割位点均相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

一种则不能HpaHpaⅡⅡ和和MspMspⅠⅠ的识别顺序都是的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’5’……G’CG_G……3’，如果其中，如果其中有有5’-5’-甲基胞嘧啶，则只有甲基胞嘧啶，则只有HpaHpaⅡⅡ能能够切割DNADNA操作技术操作技术2.4 限制性内切酶产物DNADNA操作技术操作技术2.4 限制性内切酶产物星号活力（第二活性）–PHPH–离子强度离子强度–甘油浓度过高甘油浓度过高≥10%≥10%时时–酶量酶量限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下 DNADNA操作技术操作技术2.5 DNA分子中识别位点的数目四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列λ DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点如Bgl II只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中GC含量少于50%这种方法只能粗略的估计，只有实验能确定到底有多少个识别位点DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术2.6 反应程序体系：DNA分子（溶液） 酶 缓冲液（一般pH值7.4, 含Mg2+, NaCl, 还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止失活） 水1U定义为在最佳缓冲系统和20ul体积中反应1小时，完全水解1μgDNA所需的酶量 反应条件一般为37°C，也有例外，如Taq I在65°C时活性最高。

DNADNA操作技术操作技术2.6 反应程序1）加入DNA2）加入Buffer3) 加入酶4）37°C保温1hr或过夜5) 反应终止，70°C加热、加入EDTA、或加入苯酚DNADNA操作技术操作技术2.7 酶切结果分析 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离–聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子–琼脂糖凝胶电泳DNADNA操作技术操作技术Standard Standard electrophoresielectrophoresis (a)does not s (a)does not separate DNA separate DNA fragments of fragments of different different sizes,whereas sizes,whereas gel gel electrophoresielectrophoresis (b) doess (b) doesDNADNA操作技术操作技术2.7 酶切结果分析DNA分子的检测–EB染色，DNA分子小于25ng，很难检测到–放射性自显影可检测2ngDNADNADNA操作技术操作技术2.7 酶切结果分析DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术0.5 μg的的1kb DNA Ladder 0.8%TAE琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶，EB染色染色 DNADNA操作技术操作技术2.8 估计DNA分子的大小D=a-b(logM)D:移动距离，M:分子量，a, b是恒量。

与已知大小的片段进行比较，误差约5%DNADNA操作技术操作技术Figure4.16Estimation of the sizes of DNA fragments in an agarose gel.DNADNA操作技术操作技术Figure4.17Figure4.17Using a Using a restriction map restriction map to work out to work out which restriction which restriction endonucleases endonucleases should be used should be used to obtain DNA to obtain DNA fragments fragments containing containing individual genesindividual genes. .DNADNA操作技术操作技术2.9 绘制DNA分子的酶切图谱确定每一种酶切后产生片段的分子量和数目进行双酶切比较单酶切和双酶切结果，绘制酶切图谱含糊的位点可以通过部分酶切解决DNADNA操作技术操作技术绘制酶切图谱DNADNA操作技术操作技术绘制酶切图谱DNADNA操作技术操作技术绘制酶切图谱DNADNA操作技术操作技术2.10 多酶联合酶解 对离子强度要求相同的酶，可同时酶解。

对离子强度要求不同的酶： –低盐浓度的酶先切，后补加NaCl–一种酶切后，沉淀DNA，换缓冲液DNADNA操作技术操作技术Figure4.19Ligation: the final step in construction of a recombinant DNA molecule.DNADNA操作技术操作技术Figure4.20Figure4.20The different joining The different joining reactions catalysed by reactions catalysed by DNA lligase.DNA lligase.DNADNA操作技术操作技术外源DNA与载体DNA的连接 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘性末端的更换 DNADNA操作技术操作技术3.1 相同粘性末端的连接来源–相同的酶–同尾酶问题–极性有两种可能 –同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切称为“焊死”DNADNA操作技术操作技术BamHI识别顺序5’G|GATCC G|GATCC3’ CCTAG|G CCTAG|GBgl II的识别序列5’A|GATCT A|GATCT3’ TCTAG|A TCTAG|A AGATCC　 GGATCT TCTAGG CCTAGADNADNA操作技术操作技术EaeI的识别序列PyGGCCPu(Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤）EayI的识别序列CGGCCG 连接后重组分子仅能为EaeI识别。

DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术3.2 平头末端的连接粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接 提高连接效率的方法： –加大酶用量（10倍） –加大平头末端底物的浓度–加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用 –加入单价阳离子， 150-200mM NaCl–提高反应温度 平头连接同样存在两种极性 DNADNA操作技术操作技术3.3 不同粘性末端的连接突出5'末端–KlenowKlenow补平，或补平，或S1S1核酸酶切平，然后平头连接核酸酶切平，然后平头连接突出3'末端–T4-DNApolT4-DNApol切平，然后平头连接切平，然后平头连接突出末端不同 –KlenowKlenow补平，或补平，或S1S1核酸酶切平核酸酶切平 连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点XbaI与HindIII（ XbaI恢复）， XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与Bgl II（产生ClaI位点）DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术3.4 人工粘性末端的连接 5' 5'突出的末端突出的末端 –外源片段先用外源片段先用KlenowKlenow补平；然后用补平；然后用TdTTdT补加补加polyCpolyC；载体片段也用；载体片段也用KlenowKlenow补平，加补平，加polyGpolyG，退火不，退火不经连接即可转化。

目的是：不使酶切位点遭受破经连接即可转化目的是：不使酶切位点遭受破坏 3' 3'突出的末端突出的末端 –外源片段先用外源片段先用TdTTdT加加polyGpolyG；载体片段加；载体片段加polyCpolyC；；然后退火；再用然后退火；再用KlenowKlenow补齐；连接补齐；连接 平头末端平头末端 –可直接用可直接用TdTTdT补加末端，但以加补加末端，但以加polyA/TpolyA/T为佳这样稍微加热，样稍微加热，ATAT区就会出现单链区域，然后用区就会出现单链区域，然后用S1S1核酸酶水解即可回收片段核酸酶水解即可回收片段 DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术3.5 粘端与平端的连接linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段–连接的效率较高–酶切时可能破坏DNA分子的完整adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸DNADNA操作技术操作技术1. Linkers1. Linkers如何将平末端分子变为粘性末端分子如何将平末端分子变为粘性末端分子如何将平末端分子变为粘性末端分子如何将平末端分子变为粘性末端分子? ?DNADNA操作技术操作技术注意问题注意问题注意问题注意问题DNADNA操作技术操作技术2. Adaptors2. AdaptorsDNADNA操作技术操作技术Figure4.24Figure4.24 The distinction The distinction between the between the 5’-and 3’-5’-and 3’-terminal of a terminal of a polynucleotidepolynucleotideDNADNA操作技术操作技术The use of adaptorsThe use of adaptorsDNADNA操作技术操作技术3.6 粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口–BamHI酶切片段用Klenow补平，或用S1酶切平；连接一段linker或Adaptor，使之产生EcoRI粘性末端。

这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 –由AluI更换EcoRI：AluI切开，T4-DNApol切平，另一段DNA EcoRI切开，Klenow补平，连接，原来含有AluI的片段变成含有EcoRI DNADNA操作技术操作技术DNADNA操作技术操作技术3.7 重组率 重组率：含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比较为理想的重组率为25-75% 提高重组率的方法： –连接反应条件 外源片段：载体＝2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化 –载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）–TdT在3’端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 Next ChapDNADNA操作技术操作技术。