单基因遗传病的研究策略.ppt

单基因基因遗传病的研究病的研究策略策略如如如如果果果果一一一一种种种种遗遗传传病病病病的的的的发发病病病病仅仅仅仅涉涉涉涉及及及及到到到到一一一一个个个个基基基基因因因因，，，，这这个个个个基基基基因因因因称称称称为为主主主主基基基基因因因因(major (major gene)gene)，，，，其其其其导导致的疾病称致的疾病称致的疾病称致的疾病称为单为单基因病单基因基因遗传病病单基因基因遗传病病发病的复病的复杂性性vv外外外外显显率：一定基因型个体表率：一定基因型个体表率：一定基因型个体表率：一定基因型个体表现现出疾病表型的比例出疾病表型的比例出疾病表型的比例出疾病表型的比例vv表表表表现现度：相同度：相同度：相同度：相同基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异基因型不同个体在疾病表现程度的差异vv基因多效性：基因多效性：基因多效性：基因多效性：一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效一个基因有多种生物学效应应vv遗传异质性：遗传异质性：遗传异质性：遗传异质性：表型相似而基因型不同的表型相似而基因型不同的表型相似而基因型不同的表型相似而基因型不同的现现象象象象vv从性从性从性从性遗传遗传和限性和限性和限性和限性遗传遗传：：：：常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别常染色体上的基因在不同的性别有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布有不同的表达程度和表达方式，从而造成男女性状分布上的差异上的差异上的差异上的差异vv遗传遗传早早早早现现现现象：象：象：象：疾病在世代中存在疾病在世代中存在疾病在世代中存在疾病在世代中存在发发病年病年病年病年龄龄逐逐逐逐渐渐提前或提前或提前或提前或病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况病情逐代加重的情况研究策略与方法研究策略与方法vv临床床诊断、家系断、家系调查与材料收集与材料收集vv侯侯选基因的确定基因的确定vv已知致病基因突已知致病基因突变位点的确定位点的确定vv连锁分析与未知基因的基因定位分析与未知基因的基因定位vv基因型与表基因型与表现型相关性研究型相关性研究vv发病机制的研究病机制的研究临床床诊断、家系断、家系调查与材与材料收集料收集临床床诊断断l l查阅相关资料，认识不同遗传病患查阅相关资料，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施者临床表现及其辅助诊断措施l l临床诊断：症状和体征临床诊断：症状和体征l l常规辅助检测指标常规辅助检测指标l l特殊诊断指标特殊诊断指标家系家系调查与系与系谱分析分析l l调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息l l根据根据根据根据调查资调查资料，用系料，用系料，用系料，用系谱谱中常用的符号中常用的符号中常用的符号中常用的符号绘绘制成制成制成制成系系系系谱谱l l系系系系谱谱分析：区分析：区分析：区分析：区别遗传别遗传病与非病与非病与非病与非遗传遗传病病病病￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿区区区区别单别单基因与多基因病基因与多基因病基因与多基因病基因与多基因病￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿判断判断判断判断遗传遗传方式方式方式方式大家系大家系散散发病例病例临床床遗传病家系特点病家系特点l l散发病例：对于遗传病，包括单基因遗散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。

传病，多数病例表现为散发l l小家系病例：在有家族史的病例中，多小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系数也是小家系l l大家系病例：极少数家系大家系病例：极少数家系发病个体多，病个体多，涉及涉及3-4代都有患者代都有患者收集材料收集材料l l采集采集采集采集样样品：品：品：品：￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿外周血，外周血，颊颊粘膜脱落粘膜脱落细细胞，毛囊胞，毛囊, ,          病人病人组织组织（如可以取材），（如可以取材），￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿羊水（羊水（产产前前诊诊断）断）l l采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿患者、同一家系中有相同遗传背景的患者、同一家系中有相同遗传背景的表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背景的成员景的成员收集收集临床床资料料l l病人临床上一系列指标的检测l l保存相关信息和影象资料l l病人血清或组织的保存及其酶、病理或免疫学研究侯侯选基因的确定基因的确定文献文献检索索数据库数据库v www.ncbi.nlm.nih.gov中的OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man ）数据库中整合了目前已定位的单基因病的信息v 确定自己所研究家系的可能已知候选基因或已定位的染色体候选区域根据疾病名称根据疾病名称检索索根据基因根据基因检索索检索最新文献索最新文献确定已知致病基因突确定已知致病基因突变l l获获得已知基因基因得已知基因基因得已知基因基因得已知基因基因组组序列序列序列序列l l设计设计引物或参考文献中引物引物或参考文献中引物引物或参考文献中引物引物或参考文献中引物l l根据文献，采用合适的技根据文献，采用合适的技根据文献，采用合适的技根据文献，采用合适的技术术方法方法方法方法进进行基因行基因行基因行基因突突突突变变分析（在后面分析（在后面分析（在后面分析（在后面课课程中程中程中程中详细详细介介介介绍绍））））从数据库中查阅目的基因从数据库中查阅目的基因的相关信息的相关信息 PCR-测序分析测序分析MFN2基因基因结结果果发现错义发现错义突突变变: c.281: c.281   G>A,G>A,其所在密其所在密码码子由子由CGGCGG变为变为CAG, CAG, 导导致其致其编码编码氨基酸由精氨酸氨基酸由精氨酸变为变为谷氨谷氨酰酰胺胺.  . 结论结论：：：：经查阅经查阅文献文献资资料，料， c.281 c.281   G>AG>A为为已知致病突已知致病突变变位点，可判断其位点，可判断其为该为该患者的致病突患者的致病突变变位点。

位点￿ ￿l l根据根据根据根据变变异异异异导导致的致的致的致的结结果判断果判断果判断果判断l l根据突根据突根据突根据突变变数据数据数据数据库库和文献和文献和文献和文献资资料料料料l l排除已知排除已知排除已知排除已知SNPSNPl l根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断l l在正常在正常在正常在正常对对照人群中分析照人群中分析照人群中分析照人群中分析l l保守性分析保守性分析保守性分析保守性分析l l基因功能分析基因功能分析基因功能分析基因功能分析突变分析结果的判断突变分析结果的判断连锁分析与未知基因的分析与未知基因的基因定位基因定位 利利用用被被定定位位的的基基因因与与在在同同一一染染色色体体上上另另一一遗传座座位位相相连锁的的特特点点，，将将该基基因因定定位位在在某某一一染染色体或染色体某一区色体或染色体某一区带上连锁分析连锁分析注：适于分析注：适于分析较较大的大的遗传遗传病家系，不适于病家系，不适于散散发发病例和小家系病例病例和小家系病例￿ ￿连锁连锁 重组重组遗传标记遗传标记进行行连锁分分析析时需需要要的的一一些些已已知知遗传位位点点，，这些些位位点点应按按孟孟德德尔方方式式遗传，，且且具具有有多多态性性以以便便显示示连锁关关系系，，这些些标记位点称位点称为遗传标记vvRFLP，，STR, SNP连连锁锁分分析析结结果果连连锁锁分分析析结结果果基基因因定定位位：：将将致致病病基基因因确确定定到到染染色色体体的实际位置的实际位置未知致病基因定位克隆研究未知致病基因定位克隆研究基因克隆基因克隆：确定致病：确定致病基因基因定位克隆定位克隆vv基本方法和步骤基本方法和步骤OO收收集集家家系系，，选选择择遗遗传传标标记记进进行行连连锁锁分分析，对目的基因作图定位析，对目的基因作图定位OO确确定定候候选选位位置置，，对对目目的的基基因因进进行行精精细细定位定位OO从从候候选选基基因因中中确确定定正正确确的的基基因因￿ ￿（（二二代代测序技术）测序技术）例：一个例：一个X连锁肌肉病家系致病基因连锁肌肉病家系致病基因的定位克隆研究的定位克隆研究￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿家系情况及前期研究基础家系情况及前期研究基础ØØ先证者先证者ⅢⅢ2 2临床表现近似临床表现近似DMDDMDØØ排除了排除了DMD/EMD/FHL1DMD/EMD/FHL1基因突变基因突变研究策略研究策略全基因组全基因组9090万万个个SNPSNP位点；位点；8 8例样本；例样本；商业公司完成商业公司完成选选 取取 数数 个个 SNPSNP点；点；增加增加3 3个成员个成员连连锁锁区区域域内内的的基基基基 因因因因 ：： Map Map ViewerViewer；；基基 因因 表表表表 达达达达 ：：UniGeneUniGene数数 据据库及库及HGNCHGNC网站；网站；基基 因因 功功功功 能能能能 ：：OMIMOMIM数据库数据库1 1例样本例样本(I2)(I2)；；商业公司完成商业公司完成SNPSNPSNPSNP芯片数据分析芯片数据分析芯片数据分析芯片数据分析ØØ 连锁分析连锁分析连锁分析连锁分析 提示提示X X染色体有三段连锁区域：染色体有三段连锁区域：Ø单体型分析单体型分析单体型分析单体型分析   Gene map locusGRCh37.p5 Primary Assembly (STS)Physical distance (Mb)Genetic Distance(cM)Genetic Map(Marshfield)(cM)   Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49    Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62    Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区域三段连锁区域三段连锁区域三段连锁区域精细定位分析精细定位分析精细定位分析精细定位分析ØØ将将将将Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域由由由由6.78Mb 6.78Mb 6.78Mb 6.78Mb 缩短为缩短为缩短为缩短为4.18Mb4.18Mb4.18Mb4.18Mb ØØ排除排除排除排除Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域ØØ肯定肯定肯定肯定Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域最终确定两段连锁区域Gene map locusGRCh37.p5 Primary Assembly (STS)Physical distance(Mb)Genetic Distance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52 Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06 连锁区域内包含的连锁区域内包含的连锁区域内包含的连锁区域内包含的基因基因基因基因Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域ØØ共共2828个基因个基因：：1414个个已知基因已知基因,14,14个个预测基因预测基因ØØ1414个已知基因：个已知基因： 6 6个基因在肌肉组织中表达个基因在肌肉组织中表达 （（3 3个基因表型已知，均与肌肉病无关）个基因表型已知，均与肌肉病无关） 7 7个基因不在肌肉组织表达个基因不在肌肉组织表达 1 1个基因表达情况未知个基因表达情况未知  Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2Xq24-q27.2连锁区域连锁区域连锁区域连锁区域ØØ共共272272个基因个基因：：122122个个已知基因已知基因,150,150个个未知基因未知基因ØØ122122个已知基因：个已知基因： 79 79个基因在肌肉组织中表达个基因在肌肉组织中表达 （（1818个基因表型已知，其中包括前期已经排除的个基因表型已知，其中包括前期已经排除的FHL1FHL1基因）基因） 41 41个基因不在肌肉组织表达个基因不在肌肉组织表达 2 2个基因表达情况不清楚个基因表达情况不清楚外显子组测序外显子组测序外显子组测序外显子组测序ØØ平均覆盖度：平均覆盖度：23.823.8×× ；覆盖度大于；覆盖度大于>20>20××位点占位点占53.7%53.7%ØØ在上述在上述两两个连锁个连锁区域区域测序测序深度均很低深度均很低ØØ对测序深度对测序深度>20>20的变异位点进行验证，结果均无变异的变异位点进行验证，结果均无变异存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法存在的问题及解决办法ØØ本家系本家系患者患者未进行未进行肌肉活检肌肉活检ØØ将将进行多个样本进行多个样本的的外显子组测序外显子组测序Genotype和和Phenotype相关性研究相关性研究例：非综合征型先天缺牙的分子遗例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究传学研究￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿J Dent Res,J Dent Res, 2009; 88:126-131  2009; 88:126-131  Eur J Med Genet, Eur J Med Genet, 2008; 51: 536-546 2008; 51: 536-546 Eur J Med Genet Eur J Med Genet, 2011; 54: 377-382, 2011; 54: 377-382单基因遗传病发病机制的单基因遗传病发病机制的研究研究—— 隐性突变隐性突变往往导致失去功能（loss of function）—— 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能        失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency）        获得功能：显性负效应（dominant negtive）  隐性突变和显性突变的致病机制隐性突变和显性突变的致病机制Gain of function ：： Loricrin基因突变获得核转位的新功能基因突变获得核转位的新功能 Br J Dermatol, 2008; 159:714-719 Loricrin 角皮病角皮病连锁分析与连锁分析与1q21区域连锁区域连锁发现发现Loricrin基因新突变基因新突变特殊的临床表现特殊的临床表现突变蛋白序列新功能的预测突变蛋白序列新功能的预测GFP表达载体的构建表达载体的构建细细胞胞亚亚定定位位分分析析动物模型动物模型l l过表达和基因敲除小鼠模型均表现正常表型l l转基因小鼠表现出与人类疾病相似的疾病表型，提示突变基因获得功能为其发病机制。

基因敲除小鼠表型基本正常基因敲除小鼠表型基本正常转基因小鼠表型与人类疾病相似转基因小鼠表型与人类疾病相似结结 论论 l lLoricrinLoricrin基因突基因突基因突基因突变变可引起新的疾病表型可引起新的疾病表型可引起新的疾病表型可引起新的疾病表型l lLoricrinLoricrin突突突突变变蛋白蛋白蛋白蛋白获获得新功能，通得新功能，通得新功能，通得新功能，通过过其核定其核定其核定其核定位信号介位信号介位信号介位信号介导导了突了突了突了突变变蛋白的核蛋白的核蛋白的核蛋白的核转转位位位位Haploinsufficiency ：： PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素成基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常熟过程导致糖耐受异常 Diabetologia. 2009; 52:504-13先天性无虹膜家系先天性无虹膜家系在该家系发现在该家系发现 PAX6 突变突变(c.1080C>T)导致单倍剂量不足导致单倍剂量不足  SSCP analysis DNA sequencing Ton et al. Cell 67, 1991Ton et al. Cell 67, 1991PAX6 基因及其基因及其 cDNAØØEssential for the development of the eye & brainEssential for the development of the eye & brain homozygoushomozygous mutants mutants — no— no eyes, no brain, die eyes, no brain, die heterozygous mutants heterozygous mutants — — small eyes in mice small eyes in mice aniridia in humans aniridia in humansØØEssential for the development of pancreasEssential for the development of pancreas homozygoushomozygous mutants mutants — — abnormal pancreatic structureabnormal pancreatic structurePAX6的功能的功能Hill et al. Nature 354, 1991;St-Onge et al. Nature 387, 1997; Sander et al. Genes Dev 11,1997PAX6 在胰腺发育中的功能在胰腺发育中的功能Mansouri et al. TEM 10, 1999Dohrmann et al. Mech Dev 92, 2000 PAX6 在成体胰腺中的功能在成体胰腺中的功能ØØHomozygous mice with conditional k/o PAX6 in Homozygous mice with conditional k/o PAX6 in the pancreas caused diabetesthe pancreas caused diabetes                                         ØØFour aniridia patients with PAX6 mutations Four aniridia patients with PAX6 mutations were reported to suffer from glucose intolerance were reported to suffer from glucose intolerance Ashery-Padan et al. Dev Biol 269, 2004Ashery-Padan et al. Dev Biol 269, 2004 Yasuda et al. Diabetes 51, 2002 Yasuda et al. Diabetes 51, 2002 假假 说说 PAX6 mutation?abnormal glucose homeostasisOGTT Analysis in the Aniridia PedigreeIDIDAgeAgeBMIBMI(kg m(kg m-2-2) )Glucose levels (mmol LGlucose levels (mmol L-1-1) )Clinical Clinical statusstatusAniridiaAniridiaGenotypeGenotype 0 0’ ’ 120 120’ ’ ⅡⅡⅡⅡ-6-6ⅡⅡⅡⅡ-7-7ⅢⅢⅢⅢ-2-2ⅢⅢⅢⅢ-3-3ⅢⅢⅢⅢ-5-5ⅢⅢⅢⅢ-6-6ⅢⅢⅢⅢ-8-8ⅢⅢⅢⅢ-9-9ⅢⅢⅢⅢ-10-10ⅢⅢⅢⅢ-11-11ⅢⅢⅢⅢ-13-137070686850504343414133333030404038383636323217.5817.5820.2220.2217.8817.8820.8620.8621.1521.1520.4220.4220.9920.9920.4320.4320.9620.9622.9322.9320.8320.834.554.554.084.084.864.865.255.253.693.694.274.274.914.916.056.055.275.277.747.744.664.668.048.0412.9912.9911.4111.418.658.657.807.806.626.625.885.8814.5714.579.789.7815.6115.617.317.31IGTIGTD DD DIGTIGTIGTIGTNGTNGTNGTNGTD DIGTIGTD DIGTIGT+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-1Ⅳ-2Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-7Ⅳ-9Ⅳ-91717181811111616141419.4119.4120.3320.3315.2815.2819.4119.4116.1916.194.174.173.983.984.724.725.145.144.584.587.957.956.856.855.665.666.216.217.077.07IGTIGTNGT NGT NGTNGTNGTNGTNGTNGT+ ++ ++ ++ ++ +m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢⅢⅢⅢ-15-15-15-15Ⅲ-16Ⅲ-16Ⅲ-16Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-17Ⅲ-17Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-18Ⅲ-18Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅲ-19Ⅲ-19Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-6Ⅳ-8Ⅳ-841413838343433333030151511117 7121219.9319.9321.1921.1922.3022.3020.4320.4322.8322.8317.3117.3115.4215.4215.0615.0616.5416.544.414.414.894.894.254.254.014.014.384.384.154.155.245.244.814.814.714.716.766.765.335.335.035.036.006.006.636.635.485.485.085.086.186.186.236.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT- -- -- -- -- -- -- -- -- -N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N 血糖和胰岛素水平血糖和胰岛素水平总结总结 1Aniridia caused by Aniridia caused by PAX6PAX6 gene mutation gene mutation PAX6PAX6 mutation caused impaired glucose tolerance (IGT) mutation caused impaired glucose tolerance (IGT)PAX6PAX6-related IGT was associated with age -related IGT was associated with age 问问 题题ØØDoes IGT come from deficiency of insulin?Does IGT come from deficiency of insulin?ØØDo these patients have insulin resistance?Do these patients have insulin resistance?ØØDo patients have a defect in insulin processing?Do patients have a defect in insulin processing? PAX6 Had No Effect on the Transcriptional Activity of the Insulin Promoter胰岛素耐受没有异常胰岛素耐受没有异常胰岛素原显著高胰岛素原显著高总结总结 2PAX6 PAX6 had no effect on the had no effect on the insulininsulin t transcriptionranscription IGT was not result from insulin resistanceIGT was not result from insulin resistanceIGT may come from a defect in insulin processingIGT may come from a defect in insulin processingPC1 的功能的功能Proinsulin insulinin Pancreas POMC ACTHalpha-MSHin Hypothalamus Marcinkiewicz et al. Proc Natl Acad Sci 90, 1993  Naggert et al. Nature Genetics 10, 1995ACTH和和Alpha-MSH水平水平总结总结3 Deficiency of PC1 caused by Deficiency of PC1 caused by PAX6 PAX6 mutation was indicatedmutation was indicated假假 说说 PAX6 mutation?PC1deficiencyabnormal glucose homeostasisPAX6突变小鼠表现与人相符突变小鼠表现与人相符PAX6突变导致突变导致PC1缺乏缺乏可能的调控模型可能的调控模型Thank you!。