连接产物的转化.ppt

连接产物的转化1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化；3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接；§一 实验目的§ 掌握细菌转化的一般技术和原理§二 实验原理§ 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一使受体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化§ 通常所用的受体是大肠杆菌§ 用于转化的细菌被称为感受态细胞• 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键• Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107 转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。

如在Ca2+ 的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+ 、Co2+ ）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍§ 大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化常常用用热热激激法法，，该该法法最最先先是是由由Cohen于于1972年年发发现现的的其其原原理理是是细细菌菌处处于于0℃，，CaCl2的的低低渗渗溶溶液液中中，，菌菌细细胞胞膨膨胀胀成成球球形形，，转转化化混混合合物物中中的的DNA形形成成抗抗DNase的的羟羟基基-钙钙磷磷酸酸复复合合物物粘粘附附于于细细胞胞表表面面，，经经42℃短短时时间间热热冲冲击击处处理理，，促促使使细细胞胞吸吸收收DNA复复合合物物，，在在丰丰富富培培养养基基上上生生长长数数小小时时后后，，球球状状细细胞胞复复原原并并分分裂裂增增值值，，被被转转化化的的细细菌菌中中，，重重组组子子中中基基因因得得到到表表达达，，在在选选择择性性培培养养基基平板上，可选出所需的转化子平板上，可选出所需的转化子§ 除除热热击击法法转转化化细细菌菌外外，，还还有有电电击击转转化化法法，，电电击击法法不不需需要要预预先先诱诱导导细细菌菌的的感感受受态态，，依依靠靠短短暂暂的的电电击击，，促促使使DNA进进入入细细菌菌，，转转化化率率最最高高能能达达到到109~1010转转化化子子/ug闭闭环环DNA。

因操作简便，愈来愈为人们所接受因操作简便，愈来愈为人们所接受DNA分子转化分以下几步分子转化分以下几步:§1. 吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面；§2. 转入－－双链DNA分子解链一条链进入受体菌，另一条降解；§3. 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；§4. 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译重组子的筛选重组子的筛选§抗生素标记法：抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型，菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，（如氨苄青霉素， 卡卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出的培养基上长出§互补法：互补法：现在使用的许多载体（如现在使用的许多载体（如PUC系列）有含有一个大肠杆菌系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序）的调控序列和头列和头146个氨基酸偏码区这个偏码区中插入一个多克隆位点个氨基酸偏码区这个偏码区中插入一个多克隆位点§ 受体菌则含编码受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。

的序列β－半乳糖苷酶表达，－半乳糖苷酶表达， 在底物在底物5－溴－－溴－4－氯－－氯－3－吲哚－－吲哚－β－－D－半乳糖苷（－半乳糖苷（x-gal）培养基）培养基中形成兰色菌落中形成兰色菌落§而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑基因不表达而形成白色菌斑 通过颜色不同而区分重组子和非重组通过颜色不同而区分重组子和非重组子 实验步骤：§1））将将2μl连连接接产产物物与与100μl感感受受态态细细胞胞在在冰冰上上混混匀匀，，并并静静置置30min，，42℃下下处处理理60sec，，然然后后加加入入600μl的的LB（（A-））液液体体培养基，在摇床上培养基，在摇床上37℃摇动培养摇动培养1hr§（（2））(在在LB（（A+））平平板板上上涂涂布布40μl的的X-gal和和4μlIPTG溶溶液液)待待完完全全吸吸收收后后，，将将转转化化产产物物离离心心后后悬悬浮浮，，涂涂平平板板37℃过过夜夜培养。