颅内动脉瘤破裂中核转录因子κB、Toll样受体和炎性细胞因子的表达及相关性.docx

颅内动脉瘤破裂中核转录因子κB、Toll样受体和炎性细胞因子的表达及相关性颅内动脉瘤破裂会引起动脉瘤性蛛网膜下腔出血等疾病,严重危害患者的健康[1]现阶段IA破裂的机制尚不清楚,炎症反应参与IA已经得到了广泛认可,但是具体参与机制尚不明确[2]Toll样受体可通过识别和结合内源性配体激活通路并刺激炎性因子如白细胞介素1β以及超敏C反应蛋白等的分泌,其中TLR4是最常见的一种[3]核转录因子κB可通过调节TLR4、IL-1β以及hs-CRP的表达参与炎性反应的调节[4]研究显示炎性反应也是引起IA发生的机制之一,而IA破裂会造成病灶附近脑组织缺血、缺氧以及氧化应激反应,这些均会引起脑组织细胞的损伤和凋亡,以及炎性因子的释放加重病情,研究已经发现IA会引起TLR4相关通路的激活[5]本文主要分析NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRP在IA破裂组织中的表达特点,分析其与IA破裂的相关性,为提高对IA破裂的认识提供依据1、资料和方法1.1一般资料前瞻性选择2017年4月至2019年4月通过开颅动脉瘤夹闭术获取的IA标本和IA破裂标本各35例,分别为IA组和IA破裂组,同时收集车祸或坠落脑损伤手术者的健康脑血管组织35例作为对照组。

三组患者的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05,表1)本次研究已经过本院伦理委员会批准,并经患者知情同意表1.三组一般资料比较1.2纳入和排除标准IA组和IA破裂组的纳入标准:(1)经颅脑CT以及血管造影检测确诊为IA或IA破裂[6];(2)年龄20～80岁;(3)首次发病排除标准:(1)合并颅脑手术史;(2)合并感染性疾病;(3)合并恶性肿瘤1.3qPCR检测mRNA通过qPCR检测各组样本中NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRPmRNA的水平使用Trizol试剂(Invitrogen检测公司,美国)提取各组IA组织中总RNA并检测RNA的浓度和纯度使用反转录cDNA试剂盒(Roche公司,瑞士)反转录1μgRNA用于合成cDNA(42℃60min,70℃5min,然后4℃保存)使用SYBRGreenPCRMasterMix(Roche公司,瑞士)和PCR检测系统进行qPCR实验(95℃10min,40个循环,94℃15s,60℃1min,60℃1min,4℃保存)使用GAPDH作为内参,通过比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析mRNA的相对表达水平1.4Westernblot检测蛋白通过Westernblot检测各组样本中NF-κB和TLR4的蛋白水平。

将组织裂解、离心收集总蛋白并检测蛋白浓度使用10%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳后使用PVDF膜(Bio-Rad公司,美国)转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2h分别加入一抗(稀释1∶1000)(Abcam公司,美国)室温孵育2h,后在4℃孵育过夜,加入二抗(稀释1∶5000)(Abcam公司,美国),孵育3h使用GAPDH作为内参,通过QuantityOne软件分析条带的灰度值并计算目标蛋白质的表达量1.5血清IL-1β和hs-CRP测定患者在入院时抽取外周静脉血5mL,送至本院检验科检测血清中IL-1β和hs-CRP的水平1.6统计学处理采用SPSS19.0软件进行数据处理,计量资料以(x¯±s)表示,使用t检验,计数资料(%)使用卡方检验,P<0.05为差异有显著性2、结果2.1各组NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRPmRNA水平比较IA组和IA破裂组动脉瘤组织中的NF-κB、TLR4、IL-1β、hs-CRPmRNA水平显著高于对照组(P<0.05),此外,IA破裂组动脉瘤组织中的NF-κB、TLR4、IL-1β、hs-CRPmRNA水平显著高于IA组(P<0.05,表2)。

表2.各组NF-κB、TLR4、IL-1β和hs-CRPmRNA水平比较2.2各组NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRP蛋白水平比较IA组和IA破裂组动脉瘤组织中的NF-κB、TLR4、IL-1β、hs-CRP蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),此外,IA破裂组动脉瘤组织中的NF-κB、TLR4、IL-1β、hs-CRP蛋白水平显著高于IA组(P<0.05,表3和图1)表3.各组NF-κB、TLR4、IL-1β和hs-CRP蛋白水平比较图1.Westernblot检测各组NF-κB和TLR4蛋白表达水平2.3各组血清IL-1β和hs-CRP水平比较IA组和IA破裂组血清IL-1β和hs-CRP显著高于对照组(P<0.05),此外,IA破裂组血清IL-1β和hs-CRP水平显著高于IA组(P<0.05,表4)表4.各组血清IL-1β和hs-CRP水平比较3、讨论IA是由于动脉壁出现的扩张或膨出而引起的,其中脑前循环破裂动脉瘤占绝大多数,动脉瘤具有较高的致残率显微外科手术以及介入栓塞术是外科治疗aSAH的常用方法,几年来随着栓塞材料的不断改进疗效有所改善,但其预后仍不理想[7]。

因此在临床上研究IA破裂的机理有助于及时处理IA,减少aSAH的发生NF-κB是一种重要的转录因子,可通过与启动子结合调节基因转录的水平,从而调节细胞生物学行为和炎性反应等,近年来研究显示NF-κB与动脉瘤或者aSAH的发生有关Elzbieta等[8]研究结果显示NF-κB介导的炎性反应与自噬相互作用可能与IA的发病有关Aoki等[9]研究发现前列腺素E受体可通过激活NF-κB促进IA的发生,抑制NF-κB的水平可能是治疗IA的新思路Ma等[10]研究也显示NF-κB调节炎性反应并参与IA此外,IA破裂后引起的炎性反应和氧化应激反应会促进NF-κB通路,从而加重炎性反应并导致脑组织中细胞损伤和凋亡,并与预后有关[11]鲍兵等[12]发现NF-κB的水平与IA患者的预后和归转有关,但是关于NF-κB与IA破裂的关系研究极少本研究结果显示IA组和IA破裂组动脉瘤组织中NF-κBmRNA和蛋白的水平显著高于对照组,此外,IA破裂组动脉瘤组织中NF-κBmRNA和蛋白水平显著高于IA组Zhang等[13]应用显微外科夹闭术治疗IA可减少并发症,改善临床预后,同时降低NF-κB的水平,提示NF-κB可能与IA破裂有关。

本次研究结提示NF-κB高表达也与IA的破裂有关炎性反应已经被证实参与IA的发生和发展,国内有研究显示TLR4的表达与IA发生有关[14]Liu等[15]研究认为TLR4的单核苷酸多样性与IA有关也有研究认为TLR4表达上调会引起中枢系统的炎性病变[16]此外,TLR4的激活会刺激炎性因子包括IL-1β和hs-CRP的表达此外,当动脉瘤破裂后,出血病灶周围脑组织供血供氧不足,会引局部的氧化应激反应,通过NF-κB和TLR4等相关通路引起炎性反应,并导致炎性因子水平的升高[17,18]并且研究发现hs-CRP和IL-1β与aSAH以及IA预后有关[19,20]本研究结果显示IA组和IA破裂组动脉瘤组织中的TLR4、IL-1β和hs-CRPmRNA和蛋白水平显著高于对照组,此外,IA破裂组动脉瘤组织中的TLR4、IL-1β和hs-CRPmRNA和蛋白水平显著高于IA组;IA破裂组患者血清中IL-1β和hs-CRP水平也显著高于IA组,这说明TLR4、IL-1β和hs-CRP与IA的破裂有关此外,NF-κB通路以及TLR4是调节炎性反应的重要通路,NF-κB通路以及TLR4激活后会引起炎性基因的表达,包括IL-1、hs-CRP等,并促进细胞炎性损伤和凋亡[18,19]。

结合本研究结果,提示NF-κB以及TLR4高表达可能引起炎性因子IL-1β和hs-CRP的高表达,从而引起动脉瘤的血管壁细胞进一步损伤或死亡,从而增加AI破裂的风险综上所述,与IA患者相比,IA破裂患者的动脉瘤组织中具有更高水平的NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRPmRNA和蛋白的表达,并且血清中IL-1β和hs-CRP的水平也更高,这说明NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRP可能与IA破裂有关但是本研究仅比较了IA未破裂和IA破裂患者动脉瘤组织中的各项指标的水平,并且入组例数较小,关于NF-κB、TLR4、IL-1β以及hs-CRP是否提高IA破裂的风险以及具体的作用机制仍需要进一步研究参考文献：[5]贾禄,吉宏明,任少华,等.Toll样受体4/核因子-кB信号通路在人颅内动脉瘤形成和破裂过程中的激活[J].中国药物与临床,2016,16(9):1274-1277.[6]姜睿璇,张娟,边立衡.2013年欧洲卒中组织关于颅内动脉瘤及蛛网膜下腔出血的管理指南(第二部分)[J].中国卒中杂志,2014,9(7):605-612.[12]鲍兵,陈志颖,谈丹丹,等.腰椎穿刺脑脊液置换对动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血管内栓塞术后脑脊液核因子κB和转归的影响[J].国际脑血管病杂志,2017,25(2):140-144.[14]汪子文,赵立文,张鹏飞,等.兔颅内动脉瘤Toll样受体4及血管细胞间黏附分子-1的表达[J].中华实验外科杂志,2017,34(3):420-423.[18]马春晓,周伟,闫兆月,等.动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者外周血单核细胞表面Toll样受体4的表达与脑血管痉挛的关系[J].中华实验外科杂志,2015,32(8):2000-2003.[19]雷靖安,刘志广,刘忠志,等.丁苯酞注射液联合醒脑静对动脉瘤性蛛网膜下腔出血脑血管痉挛患者血清NSE､CRP及FABP水平的影响[J].现代中西医结合杂志,2017,26(19):2143-2146.[20]刘端,李方达,廖鹏志,等.他汀类药物对腹主动脉瘤患者血清炎性因子的调节作用[J].中国医学科学院学报,2018,40(1):78-82.王明,周安海.核转录因子κB､Toll样受体和炎性细胞因子在颅内动脉瘤破裂中的表达及相关性[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(08):707-710+732.。