生物技术制药实验的指导.doc

生物技术制药实 验 指 导主编王金华 苏华伟西南林学院资源学院生物技术教研室二OO三年十二 月目 录序 言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．ii一、生物药物原料的选择、处理与保存．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1二、包埋法制备固定化细胞．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3三、吸附层析提取鸟巢菌素．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5四、液相层析分离、纯化蛋白质类药物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7五、半成品药物质量检测———蛋白质含量测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10六、蛋白质药物相对分子量测定——SDS-PAGE．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13七、蛋白质药物纯度检测——SDS-PAGE．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18八、抗体诊断——玻片直接凝集法检测血型．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20九、单克隆抗体的制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22十、植物药物制备技术实验．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25十一、大蒜细胞SOD的提取与分离．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30十二、动物药物制备实验————卵磷脂制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34十三、设计实验分——泌抗生素的微生物菌种的选育……………………附 录．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37序 言 生物技术是一门具有悠久历史、又与现代科学和技术密切结合的学科。

20世纪70年代以来，DNA重组技术等分子生物学技术的不断发展，赋予了生物技术崭新的内容，使之成为真正的高技术领域——现代生物技术它促使工农业生产和医疗卫生事业发生了革命性的变化，特别是用于医疗卫生事业的医药生物技术的发展，使疾病的治疗和诊断、药物的研究和生产以及其他卫生保健事业出现了崭新的局面其中最成功的是生物技术用于新型药物的研制，已有近30种基因工程药物投放市场，产生了巨大的社会效益和经济效益，对新药的研制、开发以及未来医药工业结构调整产生重大影响21世纪是生命科学的世纪，21世纪是新材料和先进制造技术迅速发展和广泛应用的时代，21世纪是高效、洁净和安全利用新原料的时代，21世纪是人类向空间、海洋、地球内部不断拓展的世纪，21世纪是自然科学发生重大变革、取得突破性进展的时代医药工业则被誉为21世纪的“朝阳产业”，特别是现代生物技术的迅速发展，更促进了当今世界制药工业的迅猛发展科学技术的发展、新技术的不断涌现对我国这样的发展中国家来说，既是挑战，也是机遇，而能否抓住发展机遇关键在于提高全民族的科学文化水平，造就一支具有科学精神、懂得科学方法、具有知识创新和技术创新能力的高素质劳动者队伍。

所以，发展和普及科学知识、弘扬科学精神、提倡科学方法是我们应对世纪挑战的首要策略为此，1999年8月，江总书记在视察中国科学院大连化学物理研究所时进一步强调了科普工作者的重要性：“在加强科技进步和创新的同时，我们应该大力加强全社会的科学普及工作，努力提高全民族的科学文化素质这项工作做好了，就可以为科技进步和创新提供广泛的群众基础所以我们应加速现代生物技术制药的人才培养，以迎接21世纪的挑战生物药物包括从动物、植物、微生物、人和各种海洋生物中制取的以及运用现代生物技术产生的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物它在医疗上具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小疗效可靠及营养价值高等鲜明、显著的特点，已越来越受到人们的青睐和重视而近半个世纪生命科学的飞速发展给生物药物的开发和利用赋予新的生命，使生物药物成为当今发展最快、影响最大的药物之一本书着重介绍生物技术制药过程中涉及的重要方法和技术，可根据时间和要求情况，选用部分实验每个实验后面都附有相关的思考题，书后编有附录，可供读者查阅王金华 主编 2003年12月于昆明实验一 生物药物原料的选择、处理与保存一、目的要求了解各种不同生物药物原料的来源，学习并掌握各种原料的选择原则、处理及保存方法。

二、基本原理生物药物原料以天然的生物材料为主，包括人体、动物、植物、微生物和各种海洋生物等生物药物的提取与分离方法因为原材料、药物的种类和性质的不同而有很大差异因此在选择时应注意选择有效成分含量高、原料新鲜、来源丰富、杂质含量少的原料，还要选择最佳采集时间原料的处理依原料种类的不同而不同动物原料采集后要立即处理，去处结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；植物原料确定后，要择时采集并就地去除不用的部分，将有用部分干燥、保鲜处理；微生物原料收集时，要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理原料的保存方法主要有三种：冷冻法、有机溶剂脱水法和防腐剂保鲜法本实验着重介绍有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法：植物、动物组织中常含有较多的脂肪和微生物，该类物质 不仅容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品收率因此将动、植物原料置于脂溶性有机溶剂（如丙酮、乙醚）中进行脱脂、脱水，制成丙酮干粉，长期保存三、器材剪刀，研钵，离心机，表面皿，冰箱冷丙酮四、操作步骤1、取植物组织（芹菜叶片）适量（10-20g），用水洗净，甩干；2、用剪刀将之剪碎，放入研钵，加入5V的冷丙酮，研磨成浆糊状；3、将浆糊状研磨物倒入50ml离心管，-20℃，静置30min；4、取出，于4℃，4000rpm，离心20min；5、倒去上清液，将沉淀拨至表面皿中，室温自然风干，制成丙酮干粉，4℃可长期保存。

五、实验报告思考题：1、各种不同生物药物原料的选择原则是什么？2、不同生物药物原料的处理及保存方法有哪几种？实验二 包埋法制备固定化细胞一、目的要求了解细胞、酶固定化的方法，掌握固定化细胞、固定化酶的定义和固定化后细胞和酶的性质变化，以及包埋法固定化细胞的方法二、基本原理固定化细胞主要是利用细胞中的酶类催化小分子的底物进行酶反应酶反应几乎都是在水溶液中进行的，属于均相反应均相酶反应系统自然简便，但是也有许多缺点，如溶液中的游离酶只能一次性利用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定，溶液变性和失活如能将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不溶于水的固行物，即固定化酶（或固定化细胞），则可像一般固定催化剂那样使用和处理，就可以大大提高酶的利用率与固定化酶类似，细胞也能固定化生物细胞虽然属于固相催化剂，但是因为其颗粒微小难于截留或固定，也需要固定化固定化细胞既有细胞特性和生物催化剂的功能，也具有固相催化剂的特点被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法和无载体法等包埋法是将细胞定位于凝胶网格内的技术，常用的载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶和海藻胶。

从海藻中提获得的藻酸盐（常为钠盐），是D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子（如Ca2+、Al3+）可诱导其形成海藻凝胶将微生物细胞或酶与藻酸钠溶液混合后，通过注射器针头将上述混合液滴入CaCl2溶液中，Ca2+从外部扩散进入藻酸钠-细胞混合液珠内，使藻酸钠转变为不溶的藻酸钙凝胶，由此将细胞或酶包埋其中三、器材10ml注射器，5#针头，烧杯，三角瓶，离心机，磁力搅拌器，玻棒光合细菌，4%海藻酸钠溶液，2.5% CaCl2四、操作步骤1、将光合细菌培养液在4000rpm离心20min后，收集菌体于烧杯中，备用；2、向烧杯中的菌体加入等体积的ddH2O，制成稀的悬浮菌液；3、按照1：5的比例将悬浮菌液缓慢倒入4%藻酸钠溶液中，并用玻棒不断搅拌，使之充分混匀；4、用注射器吸取10ml上述菌体-藻酸钠混合液，加上针头，滴入正在进行磁力搅拌的2.5% CaCl2溶液中；5、倾去CaCl2溶液，用ddH2O冲洗藻酸钙凝胶珠3次，滤干，4℃备用五、实验报告思考题：1、藻酸钙凝胶珠为什么呈现均匀的红色？2、固定化细胞、固定化酶的优点有哪些？3、与固定化之前的细胞、酶相比较，固定化细胞、固定化酶的性质有了什么变化？实验三 吸附层析提取鸟巢菌素一、目的要求学习吸附层析的基本原理和方法，掌握硅胶正相吸附层析的基本工艺流程。

二、基本原理吸附现象是表面的一个重要性质之一，是指固体表面对气体分子或液体分子的吸着现象，其作用力可以是物理吸附作用，也可以是化学吸附作用，如范德华力、静电力、共价结合力以及氢键作用等吸附色谱就是利用固定相对混合物中不同物质的吸附力不同而使其中的不同组分相互分离的方法硅胶（Silica Gel）是常用无机基质层析剂，它的化学成分是二氧化硅，它其实是分子量巨大的无机高分子用作吸附层析分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，其特点是表面含有很多硅羟基团（或称硅醇基团），参与各种化学键合和疏水吸附，用于层析一般认为，硅胶表面的硅羟基团可以有3种不同的类型（图3-1），其中以自由（或孤立）硅羟基对各种键合反应最为重要图3-1 硅羟基的类型三、器材硅胶（柱层析用），层析柱系统装置，烧杯，玻棒鸟巢菌发酵液，甲醇，氯仿，ddH2O四、操作步骤1、将硅胶用等体积的甲醇溶胀；2、装柱；3、用2~3V体积的甲醇平衡层析柱，流速2ml/min；4、将浓缩的鸟巢菌发酵液样品上样；5、甲醇-氯仿梯度洗脱，观察洗脱现象；6、收集洗脱样品，2ml/tube；7、将各组分样品于4℃保存，待检测五、实验报告1、分析所收集到的各段产物的疏水性强弱。

2、了解其他层析介质的性质和分离纯化依据实验四 液相层析分离、纯化蛋白质类药物一、目的要求学习凝胶过滤层析分离、纯化物质的基本原理和方法，掌握凝胶过滤层析的基本工艺流程二、基本原理凝胶过滤层析，也称为分子大小排阻层析，是一种根据蛋白质类物质分子的大小和形状来进行分离的方法与其他类型的层析技术不同，在理想的理论情况下，凝胶过滤不涉及蛋白质与填料（凝胶）之间的吸附或排斥作用凝胶过滤柱是由均匀装填的多孔凝胶微粒组成，蛋白质是基于不同蛋白质通过这些微孔的迁移能力的不同而被分离的如果一蛋白质的大小与微孔的大小相比很大，它永远也不会进入这些微孔，在通过层析柱时它就会在凝胶颗粒外面绕行而不是从颗粒内穿行如果一蛋白质或小分子（如缓冲液的成分）与凝胶过滤填料上的微孔相比很小，这些小分子就会不受阻碍地在凝胶颗粒内穿行，实际上，颗粒对于小分子来说已成了无形之物因此，大的蛋白质将比小分子更迅速地迁移通过凝郊过滤柱三、器材Sephacryl S-300HR凝胶，吸管，柱色谱分离装置，eppendorf管淀粉酶工程菌株，ddH2O，0.05M NaAC溶液四、操作步骤1、将Sephacryl S-300HR凝胶用0.05M NaAC-HAC缓冲液平衡后，装柱；2、用0.05M NaAC缓冲液过柱1h，充分平衡层析柱，流速2。