荧光实验二同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸2.doc

实验二 用同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 一、实验目的1. 了解等波长差同步扫描技术2. 学习用不同荧光法测定多组分混合物的方法二、实验原理 色氨酸(Try)、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光法测定但由于三者的激发光谱和发射光谱互相重叠，常规荧光法不能实现混合物中这三种组分的分别测定同步扫描荧光光谱技术具有简化、窄化光谱、提高选择性等优点等波长差(△λ=λem－λex)同步扫描技术可以通过△λ的选择，实现多组分混合物的选择性测定研究表明，当仅有酪氨酸和色氨酸共存时，分别利用酪氨酸(△λ＜15nm和色氨酸（△λ＞60nm）特征的同步扫描光谱可以实现这两组分的分别测定当同时含有这三种氨基酸时，可以在pH7.4的缓冲介质中，以△λ=55nm进行同步扫描，利用苯丙氨酸217nm，酪氨酸232nm和色氨酸284nm的同步荧光峰进行分别测定测定范围是苯丙氨酸：0.07～5mg/mL；酪氨酸0.02～1mg/mL；色氨酸0.001～0.5mg/mL酪氨酸在268nm处的同步荧光峰对色氨酸的测定有一定干扰，但可以校正三、仪器与试剂1. 仪器F-4500型荧光光度计，25mL带玻璃塞的比色管，吸量管2. 试剂 (1)色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸标准溶液：先配制0.5mg/mL标准溶液，再逐级稀释配制含色氨酸1ug/mL；含酪氨酸2ug/mL和含苯丙氨酸10ug/mL的工作溶液。

(2) pH7.4的 KH2PO4－NaOH缓冲液：0.5mol·L－1NaOH溶液与0.5mol·L－1KH2PO4按4:5体积混合而成四、操作步骤1. 荧光激发、发射光谱及同步光谱的测定 分别移取苯丙氨酸（4.0mL）、酪氨酸(8mL)和色氨酸（4.0mL）标准溶液于三支25mL比色管中，各加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ=55nm）光谱确定其峰值波长和强度2. 混合溶液荧光激发、发射光谱及同步光谱的测定移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只25mL比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ=55nm）光谱确定其峰值波长和强度并与步骤1中图谱加以比较1、3. 波长差△λ的确定：移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只25mL比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其同步（△λ=40、50、60、70nm，λex＝210）光谱。

并记录扫描结果其中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分别对应217nm，232nm和284nm的同步荧光峰强度注意：△λ的选择直接影同步荧光峰的峰形、峰位和强度，实验中应保持一致五、数据处理1. 从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高2．在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高六、思考题1. 同步扫描荧光技术有哪些优点？2. 观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？3.通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序 苯丙氨酸 色氨酸4.比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点附加思考题：测定混合液中三种氨基酸的含量时，若混合未知液中不含酪氨酸，则未知液中色氨酸的含量，可根据其同步扫描284nm处的同步荧光信号强度，由色氨酸的工作曲线确定；但若样品中含有酪氨酸，由于色氨酸在284nm处的同步荧光信号受到酪氨酸268nm处的同步荧光峰的影响，测定结果将偏高，偏高程度随酪氨酸含量增加而增加，可按照下式校正：F=F284－KF232－F0式中，F284为在波长284nm处对混合未知液测得的同步荧光信号；F0为空白溶液在284nm处产生的同步荧光信号；F为混和未知液中真正由色氨酸在284nm处产生的同步荧光信号；而K为在284nm 与232nm同步荧光信号的比值，可由单组分酪氨酸求得，F232为混和未知液中酪氨酸在232nm处的同步荧光信号。

由F值从色氨酸工作曲线可确定混和未知液中色氨酸的含量为什么？。