临床分子诊断学：第六章 核酸分子杂交技术和生物芯片技术.ppt

核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第六章第六章 教学大纲教学大纲【掌握】核酸分子核酸分子杂交的基本原理，核酸探交的基本原理，核酸探针的种的种类、、标　　　　　　　　记物和物和标记方法熟悉】Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、斑点或　　　　狭缝杂交、菌落杂交、组织或细胞原位杂交和荧　　　　光原位杂交的基本原理及特点；探针的纯化和　　　　检测了解】核酸分子杂交的临床应用前景具一定同源序列的两条核酸单链具一定同源序列的两条核酸单链(DNA(DNA或或RNA)RNA)在一定条在一定条件下件下( (适宜的温度和离子强度适宜的温度和离子强度) )，遵循碱基互补配对原，遵循碱基互补配对原则形成异质双链则形成异质双链(DNA/DNA(DNA/DNA、、DNA/RNADNA/RNA、、RNA/RNA)RNA/RNA)的过的过程杂交后形成的异质双链分子称为杂交分子杂交后形成的异质双链分子称为杂交分子第一节第一节 核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术核酸－变性核酸－变性变性变性DNA双螺旋链之双螺旋链之间的氢键断裂变间的氢键断裂变成单链或成单链或RNA局局部氢键断裂变成部氢键断裂变成线性单链过程。

线性单链过程 核酸－变性核酸－变性变性变性Ø 热变性热变性--温度温度温度温度Ø 酸碱变性酸碱变性--pHpH值值值值Ø 化学试剂变性化学试剂变性--尿素、尿素、尿素、尿素、甲酰胺、甲醛等甲酰胺、甲醛等甲酰胺、甲醛等甲酰胺、甲醛等核酸－变性核酸－变性Ø 黏度黏度 Ø 密度密度Ø 吸光度吸光度核酸－变性核酸－变性Ø熔解温度熔解温度(melting temperature,Tm)(melting temperature,Tm)是指加热变性过程中使是指加热变性过程中使DNADNA变性一半所需的温度，紫外光吸收值达到变性一半所需的温度，紫外光吸收值达到最大值的最大值的50%50%时1.1.DNADNA的均一性的均一性－种类和大小－种类和大小2.2.G-CG-C碱基对含量碱基对含量－正比关系－正比关系3.3.溶液的离子强度溶液的离子强度－一致性－一致性核酸－复性核酸－复性变性变性复性复性变性后互补单链变性后互补单链DNA重重新合成双螺结构，或线性新合成双螺结构，或线性单链又单链又RNA恢复的局部恢复的局部双螺结构过程双螺结构过程 Ø 黏度黏度 Ø 密度密度Ø 吸光度吸光度核酸－复性核酸－复性Ø 退火退火--热变性的热变性的DNA，缓慢降温后，核酸逐渐冷，缓慢降温后，核酸逐渐冷 却，却，DNA即可复性。

即可复性Ø 复性复性--二级反应动力学二级反应动力学Ø 复性复性—与核酸的分子大小、序列复杂程度、浓与核酸的分子大小、序列复杂程度、浓度、离子强度和温度等又关度、离子强度和温度等又关复性复性复性复性Cot1/2(mol·s/L)核酸分子－杂交核酸分子－杂交杂交杂交核酸分子杂交核酸分子杂交已知已知核酸核酸序列和待测核酸序列经历变性与复性后，形序列和待测核酸序列经历变性与复性后，形成异质双链分子成异质双链分子已知核酸已知核酸序列称为序列称为探针探针Ø 核酸探针的浓度和长度核酸探针的浓度和长度Ø 杂交的温度杂交的温度Ø 核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性Ø 杂交液的离子强度杂交液的离子强度Ø 杂交液中甲酰胺的浓度杂交液中甲酰胺的浓度降低降低TmTmØ 洗脱条件洗脱条件浓度、温度、时间和次数等浓度、温度、时间和次数等Ø 促进试剂促进试剂硫酸葡萄糖、聚丙烯酸、聚乙二醇等硫酸葡萄糖、聚丙烯酸、聚乙二醇等核酸分子杂交分类核酸分子杂交分类核酸分子核酸分子杂交交固相固相杂交交原位原位杂交交膜印迹膜印迹杂交交Southern印迹印迹杂交交Northern印迹印迹杂交交斑点斑点杂交交/狭狭缝杂交交菌落原位菌落原位杂交交液相液相杂交交核酸分子杂交分类核酸分子杂交分类分类分类电泳电泳转印转印检测内容检测内容原位杂交原位杂交组织或细胞中的组织或细胞中的DNADNA或或RNARNA菌落原位杂交菌落原位杂交细菌的细菌的DNADNA斑点杂交斑点杂交/ /狭缝杂交狭缝杂交DNADNA或或RNARNASouthern BlotSouthern Blot√√√√DNADNANorthern BlotNorthern Blot√√√√RNARNAWesthern BlotWesthern Blot√√√√蛋白质蛋白质 核酸分子杂交核酸分子杂交Ø 操作基本流程：操作基本流程：靶核酸制备靶核酸制备探针制备探针制备探针标记探针标记固定于固相载体固定于固相载体漂洗漂洗信号检测信号检测结果分析结果分析预杂交、预杂交、 杂交杂交探针制备探针制备探针标记探针标记靶核酸制备靶核酸制备 杂交杂交信号检测信号检测结果分析结果分析层析层析核酸分子杂交－固相支持物核酸分子杂交－固相支持物Ø固相支持物的选择：固相支持物的选择：①较强的核酸结合能力，且结合稳定、牢固，经杂交操较强的核酸结合能力，且结合稳定、牢固，经杂交操作后不脱落或脱落较少作后不脱落或脱落较少。

②②与核酸结合后不影响探针分子的杂交与核酸结合后不影响探针分子的杂交③③对探针非特异性吸附较少对探针非特异性吸附较少④④具有良好的柔韧性，易于操作具有良好的柔韧性，易于操作 膜印迹方法－毛细管转移膜印迹方法－毛细管转移SSC缓冲液（缓冲液（NaCl和柠檬酸钠和柠檬酸钠，pH7.0））滤纸桥滤纸桥凝胶凝胶固相膜固相膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物250-500gssc膜印迹方法－湿式电转移膜印迹方法－湿式电转移支持夹支持夹海绵海绵海绵海绵支持夹支持夹- -+ ++ ++ ++ ++ +膜印迹方法－半干式电转移膜印迹方法－半干式电转移滤纸滤纸固相膜固相膜凝胶凝胶滤纸滤纸- -- -- -接真空泵接真空泵缓冲液缓冲液滤纸滤纸膜印迹方法－真空转移膜印迹方法－真空转移固相膜固相膜凝胶凝胶SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 将待检测的将待检测的DNADNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到固相载体上，固定后再与标记的按其在凝胶中的位置转移到固相载体上，固定后再与标记的DNADNA或或RNARNA探针进行反应。

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用合适的技术进行检测，从基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小而显示出待检的片段及其相对大小  用途：检测样品中用途：检测样品中的的DNA及其含量，及其含量，了解基因的状态了解基因的状态, 如如是否有点突变、扩是否有点突变、扩增重排等增重排等 在变性条件下将待检的在变性条件下将待检的RNARNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern BlotSouthern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交用途：检测样品中用途：检测样品中是否含有基因的转是否含有基因的转录产物（录产物（mRNAmRNA）及）及其含量斑点斑点/ /狭缝印迹杂交狭缝印迹杂交 用途：用于基因组用途：用于基因组中特定基因及其表中特定基因及其表达的定性及定量研达的定性及定量研究。

究 将将RNARNA或或DNADNA变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，继变性后直接点样于硝酸纤维膜和尼龙膜上，继而用探针进行杂交检测简单、快速，可在同一张膜上同时进而用探针进行杂交检测简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；行多个样品的检测； 但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性定比例的假阳性斑点印迹斑点印迹狭缝印迹狭缝印迹菌落原位杂交菌落原位杂交用途用途: :主要应用于基主要应用于基因克隆，以及基因因克隆，以及基因文库的筛选文库的筛选原位杂交原位杂交 将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据位杂交根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：探针与待检核酸分：DNA/DNADNA/DNA、、RNA/DNARNA/DNA、、RNA/RNA RNA/RNA 杂交杂交基本步骤基本步骤: :玻片处理、组织细玻片处理、组织细胞的固定、预杂交、杂交、胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等。

冲洗及信号检测等用途用途: :1.1.染色体中的核酸定染色体中的核酸定位，位，2.2.特定基因在组织细胞特定基因在组织细胞中的表达水平，中的表达水平，3.3.组织细胞组织细胞内病原体感染内病原体感染荧光原位光原位杂交交将将DNA(DNA(或或RNA)RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记探针用特殊的核苷酸分子标记, ,然后将探针直接杂然后将探针直接杂交到染色体或交到染色体或DNADNA纤维切片上纤维切片上, ,再用与荧光素分子偶联的单克隆再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测抗体与探针分子特异性结合来检测DNADNA序列在染色体或序列在染色体或DNADNA纤维纤维切片上的定性、定位、相对定量分析切片上的定性、定位、相对定量分析FISH(fluorescence in situ hybridization)具有安全、具有安全、快速、灵敏快速、灵敏度高、探针度高、探针能长期保存、能长期保存、能同时显示能同时显示多种颜色等多种颜色等优点广泛应用于基因组广泛应用于基因组结构研究、染色体结构研究、染色体精细结构变异分析、精细结构变异分析、病毒感染分析、产病毒感染分析、产前诊断、肿瘤遗传前诊断、肿瘤遗传学等领域。

学等领域探针探针DNA染色体标本染色体标本切口平移法切口平移法前处理前处理探针探针DNA变性变性染色体染色体DNADNA变性变性单链单链DNA单链单链DNADNA用用PI、、DAPI对染色体染色对染色体染色探针探针DNA与染色体与染色体DNA分子杂交分子杂交用抗生物素蛋白用抗生物素蛋白—荧光素处理荧光素处理用荧光显微镜观察用荧光显微镜观察生物素（地高辛）标记生物素（地高辛）标记荧光原位杂交荧光原位杂交ØØ基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA探针：探针：探针：探针：一般从基因文库中选取某一基因片段与载体连接，克一般从基因文库中选取某一基因片段与载体连接，克      隆后酶切得到隆后酶切得到 制备方法简单，不易降解，标记方法成熟制备方法简单，不易降解，标记方法成熟 ØØcDNAcDNAcDNAcDNA探针：探针：探针：探针：不含内含子及高度重复序列不含内含子及高度重复序列, ,但不易获得基因表达研究但不易获得基因表达研究ØØRNARNARNARNA探探探探针针针针：：：：杂杂交交效效率率高高，，稳稳定定性性高高，，非非特特异异性性, ,未未杂杂交交探探针针可可用用RNase RNase 降降解，减少本底的干扰。

易降解，标记方法复杂解，减少本底的干扰易降解，标记方法复杂 ØØ寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：可根据需要合成相应序列；探针短可根据需要合成相应序列；探针短, ,序列复杂性低序列复杂性低, ,分子分子量小，因此杂交时间短；能该识别序列内量小，因此杂交时间短；能该识别序列内1 1个碱基的变化，可明显降低杂个碱基的变化，可明显降低杂交交TmTm值制备方法简单制备方法简单，易标记第二节第二节 核酸探针核酸探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检出的已知被标记的核苷酸链方法检出的已知被标记的核苷酸链 探针探针标记物标记物标记物探针标记物探针标记物探针标记物探针待测核酸待测核酸杂交体杂交体寡核苷酸探针寡核苷酸探针①①长长2020～～50nt50nt，较长探针杂交时间较长，较短探针特异性会，较长探针杂交时间较长，较短探针特异性会差些②②碱基成分：碱基成分：G+CG+C含量为含量为40%40%～～60%60%，超出此范围则会增加非，超出此范围则会增加非特异杂交特异杂交③③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的““发夹发夹””状结构。

状结构④④避免单一碱基的重复出现（不能多于避免单一碱基的重复出现（不能多于4 4个），如个），如-CCCCC--CCCCC-⑤⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过靶区域的同源性不能超过70%70%或有连续或有连续8 8个或更多的碱基的同个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用源，否则，该探针不能用核酸探针的标记核酸探针的标记Ø  理想探针标记物的特征：理想探针标记物的特征：a.a.高灵敏度高灵敏度b.b.三不影响：探针分子配对、理化特性、杂交特性三不影响：探针分子配对、理化特性、杂交特性c.c.标记和检测方法简单，易操作标记和检测方法简单，易操作d.d.稳定性好，易保存稳定性好，易保存e.e.检测方法灵敏度和特异性好检测方法灵敏度和特异性好f.f.对环境污染小、对人无损害对环境污染小、对人无损害g.g.价格低价格低Ø 按探针标记物性质可分为两大类：按探针标记物性质可分为两大类：I.I.放射性标记物放射性标记物II.II.非放射标记物非放射标记物Ø放射性标记物放射性标记物放射性核素：放射性核素：     32P、、35S、、 3H、、131I、、125I、、14C核酸探针的标记核酸探针的标记优点：检测特异性高；灵敏度高；假阳性率低；对碱基配对无影响。

优点：检测特异性高；灵敏度高；假阳性率低；对碱基配对无影响缺点：半衰期短不易保存，对人和环境的污染缺点：半衰期短不易保存，对人和环境的污染35S3232P P3232P PØ非放射性标记物非放射性标记物核酸探针的标记核酸探针的标记优点：安全，无污染；稳定性好优点：安全，无污染；稳定性好缺点：缺点：灵敏度较低灵敏度较低种类：种类：1. 1. 半抗原半抗原 ：： 生物素、光敏生物素、地高辛等；生物素、光敏生物素、地高辛等；2. 2. 荧光素荧光素 ：： 如异硫氰酸荧光素、罗丹明；如异硫氰酸荧光素、罗丹明；3. 3. 酶：酶： 碱性磷酸酶、辣根过氧物酶碱性磷酸酶、辣根过氧物酶 ；；生物素标记探针检测核酸过程示意图生物素标记探针检测核酸过程示意图 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法Ø缺口平移法缺口平移法I. I. 双链双链DNADNA在在DNADNA内切酶，内切酶，MgMg2+2+存在下，将存在下，将DNADNA一条链上随机切开若干个一条链上随机切开若干个 切口，切口处为切口，切口处为3 3' '末端II. DNAII. DNA聚合酶聚合酶I I在在3 3' '末端逐个加入标记核苷酸，由于该酶具有末端逐个加入标记核苷酸，由于该酶具有5 5' ' 3 3' ' 外内切酶作用，故同时在外内切酶作用，故同时在5 5’’端的核苷酸逐个切除。

这样端的核苷酸逐个切除这样3 3' '端和端和 5 5' '端同时进行，导致切口沿着端同时进行，导致切口沿着DNADNA链移动而为缺口平移链移动而为缺口平移5'3' 模板模板DNADNA3'5'DNaseⅠ+Mg2+5'3'3' 随机打开缺口随机打开缺口5'DNA聚合酶；聚合酶；[α-32P]-dCTP；；dNTPs核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法Ø随机引物法随机引物法随机引物能与各种单链随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合聚合酶的催化下，按酶的催化下，按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补另一单链完全互补另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的模板同样合成一条新的完全互补的DNA链合成时，带放标记的核苷酸掺入到新合成的合成时，带放标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中5'3' 模板模板DNADNA3'5'5'3'Klenow聚合酶；聚合酶；[α-32P]-dCTP；；dNTPs变性变性标记的探针标记的探针5'3'变性变性随机引物随机引物核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法Ø末端标记法末端标记法末端标记只是对核酸序列一端末端标记只是对核酸序列一端( (5 5’’或或 3 3’’端端) ) 进行标记。

特点进行标记特点是可得到全长是可得到全长DNADNA片段，但标记活性不高片段，但标记活性不高3 3’’末端标记末端标记----包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，分为大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法和T4DNA聚合酶标记法5 5’ 5 5’ 3 3’ 3 3’ 限制酶切限制酶切5 5’ 5 5’ 3 3’ 3 3’ KlenowKlenow片段、片段、dNTPdNTP（（ ））5 5’ 5 5’ 3 3’ 3 3’ *****核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法Ø末端标记法末端标记法5 5’末端标记末端标记----在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的γ磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’－OH基团上末端标记只是对核酸序列一端末端标记只是对核酸序列一端( (5 5’’或或 3 3’’端端) ) 进行标记特点进行标记特点是可得到全长是可得到全长DNADNA片段，但标记活性不高片段，但标记活性不高5 5’ －P－－P－5 5’ 3 3’ 3 3’ 磷酸酶磷酸酶5 5’ －OH－－OH－5 5’ 3 3’ 3 3’ *5 5’ －P－T4多核苷酸激酶、多核苷酸激酶、ATP－P－5 5’**3 3’ 3 3’ 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法Ø体外转录法体外转录法以以DNADNA为模板，利用体外转录系为模板，利用体外转录系统进行统进行RNARNA探针的制备和标记。

探针的制备和标记体外转录系统利用的是人工构体外转录系统利用的是人工构建的质粒载体，建的质粒载体，含有含有RNARNA聚合聚合酶酶识别的启动子识别的启动子T7克隆克隆T7酶切酶切切口切口T7RNA聚合酶聚合酶标记标记NTP**T75 5’3 3’T7目的基因目的基因质粒载体质粒载体核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法ØPCR标记法标记法在在PCRPCR反应体系中，将其中一种标记了的反应体系中，将其中一种标记了的dNTPdNTP加入经过扩增，标记的核苷酸掺入到经过扩增，标记的核苷酸掺入到DNADNA片断重复性，片断重复性，标记率高，简便快速大量制备　标记率高，简便快速大量制备　Ø乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀无水乙醇可以沉淀DNADNA片段，可去除片段，可去除dNTPdNTP和蛋白质和蛋白质Ø凝胶过滤柱层析法：凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，利用凝胶的分子筛作用， 将大分子将大分子DNADNA和小分子和小分子dNTPdNTP、磷酸根离子及、磷酸根离子及 寡核苷酸寡核苷酸(<80bp)(<80bp)等物质分离等物质分离Ø微柱离心法：微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析其原理与上述凝胶过滤柱层析 法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化 探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针。

探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针核酸探针的纯化核酸探针的纯化核酸杂交的信号检测－放射性核素探针核酸杂交的信号检测－放射性核素探针Ø放射自显影放射自显影在暗室中将含放射性杂交分子的滤膜与X线胶片紧密的贴在一起，放入暗盒同位素哀减所释放的β射线使胶片感光显影、定影后产生可见的图像增感屏前屏增感屏前屏增感屏后屏增感屏后屏胶片胶片转印膜转印膜增感屏前屏增感屏前屏增感屏后屏增感屏后屏胶片胶片转印膜转印膜核酸杂交的信号检测－放射性核素探针核酸杂交的信号检测－放射性核素探针Ø液闪计数法液闪计数法将杂交膜剪成小块，放入闪瓶并加入 闪烁液，用闪烁计数器计数主要用于斑点/狭缝杂交，及比较两个杂交信号的强弱首先是闪烁溶剂分子吸收射线能量成为激发态，首先是闪烁溶剂分子吸收射线能量成为激发态，再回到基态时将能量传递给闪烁体分子，闪烁再回到基态时将能量传递给闪烁体分子，闪烁体分子由激发态回到基态时，发出荧光光子体分子由激发态回到基态时，发出荧光光子荧光光子被光电倍增管接收，以脉冲信号形式荧光光子被光电倍增管接收，以脉冲信号形式输送出去将信号符合、放大、分析、显示，输送出去将信号符合、放大、分析、显示，表示出样品液中放射性强弱与大小。

表示出样品液中放射性强弱与大小核酸杂交的信号检测－非放射性核素探针核酸杂交的信号检测－非放射性核素探针Ø荧光标记探针：荧光标记探针：荧光显微镜观察荧光显微镜观察Ø酶标记探针：酶标记探针：直接底物显色直接底物显色Ø半抗原探针：半抗原探针：偶联反应偶联反应+ +显色反应显色反应标记物性质标记物性质标记分子标记分子标记方法标记方法杂交体的检测法杂交体的检测法生物素生物素Bio-11-dUTPNT、TL、PCR酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色　　光敏生物素600W 可见光照同上　　生物素化补骨脂素365nm紫外线照同上　　生物素酰-e-氨基乙酸化学合成法同上　　N-羟基丁二酰亚胺脂　酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色　　生物素肼化学合成法酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色酶酶微过氧化物酶直接法或合成法直接底物显色或用酶标抗体+ 底物显色　　碱性磷酸酯酶直接法或合成法同上荧光素荧光素罗丹明和FITC合成法直接荧光显微镜观察或酶标抗体+ 底物显色半抗原半抗原磺酸胞嘧啶化学法酶标单抗 + 底物显色　　地高辛RPL酶标抗体 + 底物显色偶联反应偶联反应显色反应显色反应Ø酶促显色法酶促显色法I.   ALP显色体系显色体系II.  HRP显色体系显色体系BCIP+NBT→紫色紫色↓DAB+H2O2→棕棕色色TMB+H2O2→蓝色蓝色BCIP/NBT紫蓝色沉淀紫蓝色沉淀Dig抗抗Dig抗体抗体碱性磷酸酶碱性磷酸酶生物芯片技术生物芯片技术第七章第七章【掌握】 生物芯片的概念，生物芯片的分生物芯片的概念，生物芯片的分类，，DNADNA 芯片、蛋白芯片、蛋白质芯片及芯片芯片及芯片实验室的概念、原理。

室的概念、原理熟悉】 生物芯片制备和检测过程了解】 SNPs检测芯片技术、表达谱芯片技术、 甲基化芯片技术、微小RNA芯片、蛋白质芯片、芯 片实验室的应用教学大纲教学大纲第一节第一节 生物芯片生物芯片生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）概念）概念指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量样品中靶分子的数量生物芯片生物芯片生物芯片生物芯片基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片表达芯片表达芯片表达芯片表达芯片基因基因基因基因组组芯芯芯芯片片片片测测序芯片序芯片序芯片序芯片蛋白蛋白蛋白蛋白质质芯芯芯芯片片片片细细胞芯片胞芯片胞芯片胞芯片组织组织芯片芯片芯片芯片芯片芯片芯片芯片实验实验室室室室 生物芯片生物芯片分类分类- -成分和用途成分和用途生物生物芯片芯片电子电子学学计算机计算机科学科学生物生物学学物理物理学学化学化学生物生物芯片芯片高通高通量量并行并行化化自动自动化化微型微型化化生物芯片生物芯片特点特点应用应用生物芯片生物芯片第二节第二节 DNADNA芯片芯片 又称基因芯片又称基因芯片, ,是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。

号的强度及分布来进行分析DNADNA芯片制备芯片制备Ø探针制备探针制备 探针设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针探针设计：根据应用目的不同，设计不同的固定于芯片上的探针 探针在芯片上的布局：选择合适的方式将探针排布在芯片上探针在芯片上的布局：选择合适的方式将探针排布在芯片上Ø载体选择与预处理载体选择与预处理 载体材料：玻片、硅片、载体材料：玻片、硅片、磁性微珠磁性微珠、尼龙膜和聚丙烯膜等尼龙膜和聚丙烯膜等 载体的化学处理：活化剂载体的化学处理：活化剂————多聚赖氨酸、氨基硅烷偶联剂等多聚赖氨酸、氨基硅烷偶联剂等Ø原位合成法原位合成法1.1.直接在载体上用四种核苷酸合成所需的探针，适用于寡核直接在载体上用四种核苷酸合成所需的探针，适用于寡核苷酸芯片和制作大规模苷酸芯片和制作大规模DNADNA探针芯片探针芯片2.2.可合成任意序列的寡聚核苷酸，密集程度高，但特异性较可合成任意序列的寡聚核苷酸，密集程度高，但特异性较差，寡核苷酸合成长度有限，成本较高，设计和制造较烦差，寡核苷酸合成长度有限，成本较高，设计和制造较烦琐费时DNADNA芯片的制备芯片的制备光导原位合成法光导原位合成法原位喷墨合成原位喷墨合成 分子印章多次压印合成分子印章多次压印合成 光导原位合成法光导原位合成法Ø直接点样法直接点样法1.1.将预先合成好的将预先合成好的DNADNA或或cDNAcDNA等通过特定的高速点样机直接等通过特定的高速点样机直接点在芯片载体上，并用理化方法固定。

点在芯片载体上，并用理化方法固定2.2.技术成熟，灵活性大，成本较低，速度快，多用于大片段技术成熟，灵活性大，成本较低，速度快，多用于大片段DNADNA探针芯片探针芯片DNADNA芯片的制备芯片的制备探探针设计载体体选择与与处理理点点样样品样品的制备的制备分离分离纯化化扩增增•PCR•RT-PCR标记•生物素生物素•荧光光•放射性同位素放射性同位素••DNA••RNA杂交与杂交信号检测杂交与杂交信号检测Ø杂交反应：与传统的杂交方法类似杂交反应：与传统的杂交方法类似 Ø杂交信号的检测：杂交信号的检测：荧光信号荧光信号Ø数据分析：芯片杂交图谱的处理与存储由专门设计的软数据分析：芯片杂交图谱的处理与存储由专门设计的软 件来完成件来完成 u共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低u质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置探针合成较复杂判断突变基因的序列位置探针合成较复杂u化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。

等DNADNA芯片的临床应用芯片的临床应用 Ø基因型、基因突变和多态性分析基因型、基因突变和多态性分析 Ø疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤 Ø指导用药及治疗方案指导用药及治疗方案Ø药物筛选药物筛选Ø基因表达分析基因表达分析 Ø预防医学预防医学 第二节第二节 蛋白质蛋白质芯片芯片 又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基, ,将其有将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系它分子之间的相互作用关系 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片第一第一 蛋白质蛋白质芯片芯片 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片载体载体抗体抗体待检蛋白待检蛋白 标记标记抗体抗体载体载体探针探针( (抗体抗体) )待检蛋白待检蛋白 标记标记抗体抗体正相正相反相反相蛋白质蛋白质芯片的制备芯片的制备芯片制备芯片制备•载体：体：滤膜和玻片膜和玻片•探探针：抗原、抗体、：抗原、抗体、酶、化学基、化学基团、受体等、受体等•点点样法：接触点法：接触点样和和喷墨点墨点样样品制备样品制备•各种各种样本本•简单快速快速杂交与信号交与信号分析分析•直接直接检测•间接接检测Ø特异性抗原抗体的检测特异性抗原抗体的检测 Ø生化反应的检测生化反应的检测 Ø疾病诊断疾病诊断 Ø对疾病分子机制的研究对疾病分子机制的研究 Ø药物筛选及新药的研制开发药物筛选及新药的研制开发 蛋白质芯片蛋白质芯片的临床应用的临床应用 芯片实验室芯片实验室 是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。

它是通过分析应过程，并对其产物进行分析的一种技术它是通过分析化学、微机电加工（化学、微机电加工（MEMS）、计算机、电子学、材料科）、计算机、电子学、材料科学与生物学、医学和工程学学与生物学、医学和工程学等交叉来实现化学分析检测等交叉来实现化学分析检测即实现从试样处理到检测的即实现从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成整体微型化、自动化、集成化与便携化这一目标化与便携化这一目标芯片材料芯片材料•硅片硅片•石英石英基片基片•高分高分子聚子聚合物合物加工工艺加工工艺•紫外紫外光蚀光蚀刻刻•软蚀软蚀刻刻•LIGALIGA技术技术微流体微流体驱动•电渗渗驱动•压力力驱动信号信号检测•光学光学检测•电化化学学检测•质谱检测芯片实验室技术芯片实验室技术芯片实验室（芯片实验室（Lab-on-a-chip））Ø常用检测方法常用检测方法1. 光学检测光学检测1）荧光检测）荧光检测2）吸光度检测）吸光度检测3）化学发光检测）化学发光检测2. 电化学检测电化学检测1）安培检测）安培检测2）电导检测）电导检测3）电位检测）电位检测3. 质谱检测质谱检测芯片实验室芯片实验室Ø芯片实验室的应用芯片实验室的应用1. 生物大分子的分析生物大分子的分析2. 细胞生物学研究细胞生物学研究3. 疾病诊断疾病诊断4. 药物筛选药物筛选。