DNA多态性分型技术四川大学讲义.ppt

LOGO第三节第三节 DNA多态性分型技术多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院四川大学华西公共卫生学院 张薇薇张薇薇Email: solozww@. Q Q: 363002530  分型技术有那些分型技术有那些?- 血清学分型血清学分型 - 生物化学分型生物化学分型 - 噬菌体分型噬菌体分型………….Ø 传统的分型技术传统的分型技术Ø分子生物学分型技术分子生物学分型技术?- PFGE- 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析- PCR技术技术- 质粒图谱质粒图谱脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE原原 理理Ø 琼脂糖凝胶依靠不同的琼脂糖凝胶依靠不同的分子筛效应分子筛效应对大小不同的对大小不同的DNA分子进分子进行分离超过一定大小的线状双链行分离超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移相同速率迁移 大于该极限长度（大于该极限长度（40kb）后）后DNA的迁移速率几乎与分子大的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。

但小无关，而主要决定于电场强度但 PEGE 解决了这一问题解决了这一问题原原 理理PFGE利利用用定定时时改改变变电电场场方方向向的的交交流流电电源源，，每每次次电电流流方方向向改改变变持持续续l s到到5min左左右右，，然然后后改改变变电电流流方方向向反反复复循循环环，，故故称称为为脉脉冲冲式式交交变变电电场场随随着着电电场场方方向向的的交交替替变变化化，，DNA分分子子呈呈“Z”形形向向前前运运动动每每改改变变一一次次电电场场方方向向，，大大的的伸伸展展的的DNA分分子子就就必必须须重重新新定定向向，，在在新新的的方方向向上上通通过过凝凝胶胶重重新新定定向向所所需需的的时时间间与与DNA分子的长度成正比分子的长度成正比B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图（（1））细菌培养细菌培养 （（2））制备胶块制备胶块 （（3））菌体裂解菌体裂解 （（4））胶块洗涤胶块洗涤 （（5））酶切酶切 （（6）电泳）电泳 （（7））结果处理结果处理 PFGE图谱获得过程图谱获得过程最大限度的最大限度的保证全基因保证全基因组的完整性组的完整性脉冲式交变脉冲式交变电场电场Ø PFGE 优势优势重复性好重复性好,分辨力强分辨力强,被誉为细菌分子生物学分型技术的被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准金标准”Ø PFGE 的局限性的局限性• 无法分辨点突变、微小突变无法分辨点突变、微小突变• 内切酶选择很关键，否则无法找到图谱内切酶选择很关键，否则无法找到图谱• 费时，仪器要求高，技术要求高，成本较高费时，仪器要求高，技术要求高，成本较高PFGE的优势和局限性的优势和局限性任何一种技术都不是完美的！任何一种技术都不是完美的！ 还有没有其他技术作为补充？还有没有其他技术作为补充？DNA多态性多态性 ?分型技术分型技术?Yes!自然界的生物的个体差异自然界的生物的个体差异我是独一我是独一无二滴无二滴!不同不同or 差异差异? 多多态性性（（polymorphism））Ø定定义: 是指在一个生物群体中，同是指在一个生物群体中，同时和和经常存在常存在两种两种或多种不或多种不连续的的变异型或基因型或等位基因异型或基因型或等位基因，亦称，亦称遗传多多态性或基因多性或基因多态性性 (genetic polymorphism). 从本从本质上来上来讲，多，多态性的性的产生在于生在于基因水平基因水平上的上的变异，异，一般一般发生在基因序列中生在基因序列中不不编码蛋白的区域蛋白的区域和和没有重要没有重要调节功能功能的区域。

的区域 DNA多态性在微生物中的实际意义？多态性在微生物中的实际意义？Ø将导致将导致 ——不同的细菌亚型不同的细菌亚型 ——耐药菌株出现耐药菌株出现 ——毒力变异株出现毒力变异株出现 ——抗原漂移与抗原变异抗原漂移与抗原变异 在疾病预防控制中的应用在疾病预防控制中的应用Ø同源性追踪同源性追踪Ø细菌分型细菌分型Ø传染控制传染控制DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法Ø 限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP)Ø 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP)Ø 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD)Ø 细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术 (rep-PCR)Ø 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法Ø 限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP)Ø 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP)Ø 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD)Ø 细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术 (rep-PCR)Ø 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。

—— 1974年首创，以年首创，以DNA-DNA杂交为基础杂交为基础的的第一代遗传标记第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针印迹技术、探针-杂交技术的综合应用杂交技术的综合应用 一、限制性片段长度多态性分析一、限制性片段长度多态性分析Restriction fragment length polymorphism，，RFLP Ø因因此此，，RFLP即即是是基基于于限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶酶酶切切消消化化核核酸酸及及标标记记的的DNA探探针针能能与与任任何何序序列列相相似似的的片片段段杂杂交交，，通通过过片片段段长长度度变变异异性性来来检检测测生生物物体体多多态态性性基基 本本 原原 理理 每每种种生生物物基基因因型型具具有有其其独独特特的的特特征征，，及及独独特特的的限限制制酶酶识识别别序序列列分分布布，，其其基基因因组组DNA在在限限制制性性内内切切酶酶作作用用下下，，产产生生相相当当多多的的大大小小不不等等片片段段，，这这些些片片段段经经电电泳泳以以后后几几乎乎是是连连续续排排列列的的，，如如用用放放射射性性同同位位素素标标记记的的DNA作作探探针针，，将将与与被被标标记记的的DNA相相关的片段检测出来，即可构建出关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱多态性图谱。

核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理v 核核酸酸经经加加热热变变性性后后，，在在低低于于变变性性温温度度20℃20℃~ 30℃30℃时时，，反反应应系系统统中中加加入入的的核核酸酸探探针针与与待待测测核核酸酸样样品品中中具具有有互互补补序序列列的的单单链链DNADNA或或RNARNA形形成成双双链链结结构构，，通通过过检检测测标标记记信信号号即即可检测特定的核苷酸片段可检测特定的核苷酸片段 RFLP操作流程图操作流程图基本基本方法方法 转移电泳槽聚合酶链反应聚合酶链反应-限制性片段长度多态限制性片段长度多态性分析技术性分析技术 PCR-RFLP基本原理基本原理 结结合合PCR技技术术与与RFLP技技术术的的优优点点，，其其基基本本原原理理是是对对目目的的基基因因片片段段PCR扩扩增增后后，，利利用用多多种种限限制制性性内内切切酶酶，，对对扩扩增增产产物物进进行行酶酶切切，，不不同同基基因因序序列列，，不不同同限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切扩扩增增产产物物，，在在电电泳泳后后可可产产生生不不同同电电泳泳图图谱谱，，通通过过对对电电泳泳图图谱谱的的分分析析，，得得出出基基因因多多态性结果。

态性结果2024/9/20四川大学华西公卫 裴晓方 26Kary Mullis1993 年因此荣获诺贝尔化学奖年因此荣获诺贝尔化学奖 v聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或或RNA片段的技术片段的技术 v由变性由变性 、、 退火退火 、、 延伸三个基本步骤构成延伸三个基本步骤构成 Ø PCR反应五要素的优化反应五要素的优化 1、多聚核苷酸引物、多聚核苷酸引物 2、、Taq DNA聚合酶聚合酶 3、、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）（三磷酸脱氧核苷酸） 4、模板核酸、模板核酸 5、缓冲液、缓冲液基基 本本 程程 序序1. 提取提取DNA2. 设计特异引物进行目的基因设计特异引物进行目的基因PCR反应反应3. 将将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切扩增产物选用合适限制性内切酶酶切4. 将酶切出来的具各种长度的将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂片段在琼脂 糖凝胶上电泳分离糖凝胶上电泳分离5. 对显示出来的带谱进行分析对显示出来的带谱进行分析 RFLP与与PCR-RFLP的应用的应用1.结核分枝杆菌结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析分析2.厌氧菌厌氧菌16SrRNA基因基因PCR-RFLP分析分析 3.其他其他 我的肥胖课题我的肥胖课题PPAR-γ2及及UCP2基因多态性与成都地区基因多态性与成都地区单纯性肥胖相关性初探单纯性肥胖相关性初探 ØPPAR-γ2 调节脂肪组织分化，脂质代谢方面发挥关键作用调节脂肪组织分化，脂质代谢方面发挥关键作用 其基因突变发生于染色体其基因突变发生于染色体3p25 外显子外显子2的第的第12位密码子位密码子CCA-GCA突变突变 造成造成脯氨酸转变为丙氨酸脯氨酸转变为丙氨酸，即，即PA多态性多态性 ØUCP2 调节机体的基础代谢率调节机体的基础代谢率(BMR)来控制体重来控制体重 其定位于人类其定位于人类11号染色体号染色体(11q13) 外显子外显子2 ，第，第55位密码子位密码子GCA-GTA突变突变 造成造成丙氨酸转变缬氨酸，即丙氨酸转变缬氨酸，即AV多态性多态性 600bp 500bp 400bp 300bp 250bp 200bp 150bp 126bp 100bp 98bp Maker 1 2 3图9 UCP2 PCR产物经BbvⅠ内切酶酶切后3.5%琼脂糖凝胶电泳结果注：基因型为基因型为AA型型:被酶解为98bp,1条带(第3泳道); 基因型为基因型为AV型型:被酶解为126bp、98bp，2条带(第1泳道) 基因型为基因型为VV型型:被酶解，仍为126bp l条带(第2泳道)A VV VAADNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法Ø 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP)Ø 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP)Ø 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD)Ø 细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术 (rep-PCR)Ø 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。

 二、扩增片段长度多态性分析技术二、扩增片段长度多态性分析技术Amplified fragment length polymorphism，，AFLP —— 结结合合了了限限制制性性酶酶切切消消化化的的可可靠靠性性和和严严格格的的PCR退退火火条条件件，，有有高高度度特特异异性性，，既既克克服服了了RFLP技技术术中中Southen杂杂交交繁繁琐琐和和耗耗时时的的缺缺点点，，又又解解决决了了RAPD等等技术中非特异技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题扩增引起的可信度问题 AFLP技术的发明技术的发明基基 本本 原原 理理 AFLP指指纹纹图图谱谱是是通通过过PCR技技术术扩扩增增基基因因组组DNA限限制制性性酶酶切切片片段段，，然然后后在在高高分分辨辨率率聚聚丙丙烯烯酰酰胺凝胶或毛细管凝胶中胺凝胶或毛细管凝胶中电泳电泳而获得 AFLP技技术术检检测测的的是是酶酶切切位位点点单单核核苷苷酸酸改改变变或或其其临临近近的的用用于于AFLP引引物物退退火火的的核核苷苷酸酸改改变变所所致的序列多态性致的序列多态性补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图基因组基因组DNA提取提取酶切与接头连接酶切与接头连接PCR扩增扩增电泳分析电泳分析基本程序基本程序例子：例子：EWGLI制定的军团菌制定的军团菌AFLP分型标准方法分型标准方法1. 细菌培养和模板制备细菌培养和模板制备 初初次次分分离离的的军军团团菌菌单单个个菌菌株株在在BCYE-α琼琼脂脂平平板板上上二二次次传传代代，，35~37℃培培养养2~3d，，确确定定为为纯纯培培养养。

挑挑取取次次代代纯纯培培养养菌菌落落用用Nucleon BACC2配配套套DNA提提取取液液，，RNase A酶酶消消化化后后提提取取基基因因组组DNA在在260nm吸吸光光度度测测定定基基因因组组DNA浓度 2. 限制性酶切与连接反应限制性酶切与连接反应 限制性酶切与连接反应体系限制性酶切与连接反应体系包括包括基因组基因组DNA、、接头接头AFLP-LG1（（5’-CTCGTAGACTGCG TACATGCA-3’）、）、接头接头AFLP-LG2（（5’-TGTACGCAGTCTAC-3’）、）、PstⅠ酶酶、、T4连接酶连接酶、、1×酶连接缓冲液，酶连接缓冲液，37℃反反应应3h 与接头连接好的标记与接头连接好的标记DNA片段用片段用2.5mol/L醋酸胺、醋酸胺、纯乙醇沉淀室温孵育纯乙醇沉淀室温孵育5min后，后，4℃ 12000×g离心离心10min，，70%乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入乙醇洗一次，沉淀物干燥后加入100μl TE缓冲液配成悬液，缓冲液配成悬液，-20℃保存3. PCR扩增扩增 PCR扩扩增增反反应应采采用用处处理理过过的的固固化化Taq酶酶珠珠，，反反应应体体系系包包括括模模板板DNA ，，选选择择性性引引物物（（AFLP-PstⅠⅠ-G：：5’-GACTGCGTACATGCAGG-3’）），，dNTP，，2.5mmol/L MgCl2。

热热循循环环参参数数为为：：94℃℃ 1min，，60℃℃ 1min，，72℃℃ 2.5min，循环，循环33次 4. 凝胶电泳凝胶电泳 1.5%琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，，电电压压3.45V/cm，，电电泳泳4h需需在在每每一一个个样样品品电电泳泳带带旁旁加加一一个个分分子子量量标标记记条条带带每每块块胶胶的的第第一一个个样样品品孔孔加加入入来来源源于于EWGLI标标 准准 化化 分分 型型 的的 Dresden AFLP015型型AFLP产产物物（（EUL No.137））凝凝胶胶经经EB染染色色30min，紫外光下照相或数字记录紫外光下照相或数字记录5. 数据分析数据分析 将将未未知知型型在在EWGLI建建立立的的军军团团菌菌AFLP型型数数据据库库中中分分析析，，聚聚类类分分析析以以条条带带的的选选择择为为基基础础，，分分群群分分析析通通过过DICE系系数数和和应应用用平平均均数数的的非非加加权权成成组组配配对对法法（（UDGMA））条条带带位位置置容容许许误误差差=2%，，最最优优化化位位置置=0.5%可可分分析析300bp~2500bp的的DNA扩增片段。

扩增片段补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图 影影 响响 因因 素素1. 限制性内切酶限制性内切酶（（1）一般采用）一般采用双酶切双酶切（（2）由一个）由一个高频高频内切酶和一个内切酶和一个低频低频内切酶组成内切酶组成（（3）一般）一般高（高（G+C））摩尔分数的基因组选择识别位摩尔分数的基因组选择识别位点富含（点富含（G+C）的内切酶组合；）的内切酶组合；低（低（G+C））摩尔分摩尔分数的基因组选择识别位点富含数的基因组选择识别位点富含AT的内切酶组合的内切酶组合（（4）酶切反应对）酶切反应对模板质量模板质量要求很高要求很高（（5）酶切时间）酶切时间1 ～～3h（（6））DNA含量一般含量一般0.5μg左右，左右，DNA含量不应太高含量不应太高 2. 接头接头 接接头头是是人人工工合合成成的的一一段段短短核核苷苷酸酸双双链链，，一一般般长长度度是是11~17个个核核苷苷酸酸，，由由中中心心序序列列和和限限制制酶酶切切特特异异序序列列两两部部分分组组成成注注意意接接头头5’端端为为非非磷磷酸酸化化，，以以防防接接头头间间的的连连接接并并保保证证其其只只能能在在3’端端与与限限制性片段连接。

制性片段连接 ApaⅠⅠ(GGGCC/C)接头的结构接头的结构 5’- TCGTAGACTGCGTACA GGCC-3’ 3’- CATCTGACGCATGT-5’中心序列中心序列酶切位点酶切位点补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图3. 引物设计引物设计 引物由三部分组成：与引物由三部分组成：与接头序列匹配的中心序列接头序列匹配的中心序列，相，相应的应的酶切位点酶切位点和和3’端的选择性碱基端的选择性碱基如如ApaⅠⅠ 引物：引物： 5’-GACTGCGTACA GGCCC NNN-3’ 中心序列中心序列 ApaⅠⅠ切点切点 选择性碱基选择性碱基 重重要要特特征征是是所所有有引引物物5’ 端端是是G碱碱基基, 可可有有效效防防止止双双链的形成引物链的形成引物 设设计计主主要要在在选选择择性性碱碱基基数数目目及及组组合合上上选选择择性性碱碱基基通通常常为为1～～3个个，，对对基基因因组组较较复复杂杂的的生生物物体体在在两两个个引引物物的的3’端端至至少少有有3个个选选择择性性核核苷苷酸酸才才能能获获得得合合适适指指纹纹图图，，而细菌基因组小，一般而细菌基因组小，一般1个选择性核苷酸即足够了。

个选择性核苷酸即足够了补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图GG4. 扩增条件扩增条件 AFLP反反应应条条件件与与常常规规PCR主主要要不不同同之之处处是是采采用用温温度度梯梯度度PCR，，即即PCR始始于于高高温温复复性性（（一一般般采采用用65℃℃，，比比常常规规PCR退退火火温温度度高高10℃℃左左右右））以以期期获获得得最最佳佳选选择择性性，，以以后后退退火火温温度度逐逐步步降降低低（（每每循循环环降降低低0.7℃℃）），，一一直直降降到到最最适适退退火火温温度度，，然然后后在在这这个个温温度度下下完完成成其其余余PCR循环 对于复杂基因，一般采用对于复杂基因，一般采用两步法扩增两步法扩增 应应 用用 1. 细细菌菌分分型型 军军团团菌菌、、大大肠肠杆杆菌菌、、根根瘤瘤土土壤壤杆杆菌菌、、表表皮皮葡葡萄萄球球菌菌、、单单核核细细胞胞增增生生李李斯斯特特菌菌、、黄黄杆杆菌菌属属、、气气单单胞胞菌菌属属、、梭梭状状杆杆菌菌属属、、不不动动杆杆菌菌属属、、假假单单胞胞菌菌属和弧菌属等属和弧菌属等 2. 细细菌菌鉴鉴定定 芽芽孢孢杆杆菌菌属属、、炭炭疽疽芽芽孢孢杆杆菌菌、、蜡蜡样样芽芽孢孢杆杆菌菌、、苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌、、大大肠肠杆杆菌菌、、耶耶尔尔森森菌菌、、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等。

金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等3. 流行病学调查流行病学调查 AFLP AT ESR: TOWARDS AN INTERNATIONAL STANDARDA. butzleriC. coliC. jejuniDNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法Ø 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP)Ø 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP)Ø 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD)Ø 细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术 (rep-PCR)Ø 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 三、随机扩增多态性三、随机扩增多态性DNA分析技术分析技术Random Amplified Polymorphism DNA，， RAPD —— 以以PCR技技术术为为背背景景，，以以人人工工合合成成的的碱碱基基顺顺序序随随机机排排列列的的寡寡核核苷苷酸酸单单链链为为引引物物，，对对所所研研究究的的基基因因组组DNA进进行行PCR扩扩增增，，经经电电泳泳分分离离后后产产生生DNA指纹图谱指纹图谱。

基基 本本 原原 理理 模模板板DNA经经92～～94℃℃变变性性解解链链后后，，在在较较低低温温度度下下退退火火，，此此时时，，有有许许多多位位点点能能与与随随机机合合成成的的短短引引物物互互补补而而形形成成双双链链结结构构如如果果某某两两位位点点间间在在可可扩扩增增范范围围之之内内，，且且分分别别位位于于互互补补的的两两条条单单链链上上，，并并且且与与引引物物的的3’端端相相对对应应，，就就可可以以通通过过PCR得到一个扩增产物得到一个扩增产物基基 本本 原原 理理 RAPD所所用用的的一一系系列列DNA引引物物序序列列各各不不相相同同，，但但对对于于任任意意特特定定引引物物，，它它同同基基因因组组DNA序序列列有有其其特特定定结结合合位位点点，，如如果果基基因因组组在在这这些些区区域域发发生生片片段段插插入入、、缺缺失失或或碱碱基基突突变变就就可可能能导导致致这这些些特特定定结结合合位位点点分分布布发发生生相相应应变变化化，，而而使使PCR产产物物增增加、减少或发生分子量改变，加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱产生多态性图谱总总DNA提取提取随机引物合成随机引物合成PCR扩增扩增随机引物筛选随机引物筛选电泳检测电泳检测图谱分析图谱分析基本程序基本程序DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法Ø 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP)Ø 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP)Ø 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD)Ø 细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术 (rep-PCR)Ø 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。

细菌基因组重复序列细菌基因组重复序列PCR技术技术repetitive-element PCR, rep-PCR—— 一种基于一种基于PCR的的DNA标记技术标记技术rep-PCR-原理原理 rep-PCR技技术术是是利利用用基基因因组组中中广广泛泛分分布布的的短短重重复复序序列列（（repetitive sequences)为为引引物物进进行行PCR扩扩增增，，通通过过对对PCR产产物物的的电电泳泳结结果果进进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异行比较，来分析菌株间基因组存在的差异rep-PCR-短重复序列短重复序列 目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有：：基因外重复回文序列基因外重复回文序列（（Repetitive Intergenic Palindrome, REP)肠细菌基因间共有重复序列肠细菌基因间共有重复序列（（Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC)rep-PCR-短重复序列短重复序列 两两者者的的共共同同特特征征是是它它们们在在细细菌菌基基因因组组中中存存在在着着菌菌株株、、种种、、属属水水平平上上的的分分布布和和拷拷贝贝数数量量的的差差异异，，而而序序列列本本身身在在进进化化过过程程中中又又具具有有较较强强的的保保守守性性。

基基于于这这两两种种短短重重复复序序列列的的PCR就就成成为为rep-PCR的的2个重要的技术个重要的技术 Ø REP-PCRØ ERIC-PCR两种短重复序列的特点及功能两种短重复序列的特点及功能REP序列序列 基基因因外外重重复复回回文文序序列列（（REP））又又称称回回文文单单位位，，其其结结构构特特点点是是回回文文性性质质，，其其转转录录的的mRNA有有形形成成茎茎-环环（（stem-loop）结构的潜能结构的潜能 REP家家族族序序列列由由38bp构构成成，，含含有有6个个非非常常保保守守的的位位点及点及5bp构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环 REP家家族族序序列列广广泛泛分分布布在在大大肠肠埃埃希希菌菌和和沙沙门门菌菌基基因因组组内内REP序序列列可可以以单单独独出出现现或或增增加加为为4个个串串联联的的重重复复单单位位在在E.coli的的染染色色体体上上，，存存在在500到到1000个个的的REP串串联联重重复复单单位位，，在在沙沙门门菌菌上上REP串串联联重重复复单单位位约约占占基基因因组组的的1%。

REP序列的功能：序列的功能：转录终止作用；转录终止作用；稳定稳定mRNA；；在体内染色体区段的组织作用在体内染色体区段的组织作用rep-PCR-REP-PCR技术技术 根根据据REP这这段段高高度度保保守守的的重重复复序序列列设设计计引引物物，，扩扩增增两两段段REP之之间间的的片片段段，，扩扩增增产产物物的的数数量量和和片片段段长长短短的的不不同同就就直直接接反反映映了了基基因因组组DNA的的差差异异，，从从而而可可对对菌菌株株进进行行分分型型和和同同源源性性分分析析，，这这就就是是rep-PCR技技术术中的中的REP-PCR技术ERIC序列序列 肠肠细细菌菌基基因因间间共共有有重重复复序序列列（（ERIC））长长约约126bp，，其其中中包包含含几几个个反反向向重重复复序序列列，，具具有有非非常常保保守守的的中中央央倒倒置置重重复复区区，，转转录录后后的的mRNAmRNA形形成成茎茎- -环结构 当当茎茎环环结结构构中中位位于于茎茎部部位位的的一一个个碱碱基基发发生生改改变变时时，，与与其其相相对对应应的的碱碱基基也也要要发发生生相相应应的的改改变，从而保证二级结构的稳定。

变，从而保证二级结构的稳定 ERICERIC序序列列的的功功能能目目前前还还不不太太清清楚楚，，在在一一些些研研究究中，中，ERICERIC被认为：被认为：Ø 可能有助于相邻基因的表达可能有助于相邻基因的表达Ø 也可能与细菌基因组局部区域的组织有关也可能与细菌基因组局部区域的组织有关Ø 或或认认为为位位于于基基因因3’末末端端的的ERIC可可防防止止外外切切核核酸酸 酶对基因酶对基因3’末端的降解末端的降解ERIC序列的功能序列的功能 依依据据ERIC重重复复序序列列设设计计引引物物，，对对细细菌菌基基因因组组DNA进进行行扩扩增增，，可可产产生生DNA指指纹纹图图谱谱在在一一定定范范围围内内，，DNA迁迁延延带带的的大大小小和和多多少少代代表表着着此此重重复复序序列列间间的的距距离离和和重重复复次次数数，，因因此此，，基基因因组组DNA的的差差异异可可清清晰晰地地显显示示在指纹图谱上在指纹图谱上 这就叫这就叫rep-PCR技术的技术的ERIC-PCR技术rep-PCR-ERIC-PCR技术技术DNA模板提取模板提取设计引物设计引物PCR扩增扩增琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳结果分析结果分析rep-PCR-操作流程操作流程rep-PCR-应用应用在在李斯特菌李斯特菌种、株鉴定中的应用种、株鉴定中的应用在在肠杆菌科肠杆菌科细菌鉴定、分类中的应用细菌鉴定、分类中的应用在其他菌株分类和鉴定中的应用在其他菌株分类和鉴定中的应用讨讨 论论1. 每种分析方法的优缺点每种分析方法的优缺点2. 请列出下段基因在请列出下段基因在AFLP技术中所使用的技术中所使用的接头和引物接头和引物,并详细列出连接示意图并详细列出连接示意图5’-GGGCCC--------------------GAATTC-3’3’-CCCGGG--------------------CTTAAG-5’ Thanks ！！ 。