生物化学蛋白质的性质实验.doc
25页
生物化学实验讲义实验一 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应实验目的1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义一、茚三酮反应1.实验原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸在定性、定量测定中，应严防干扰物存在该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色2.材料、仪器与试剂蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液3.实验操作①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现二、黄色反应1.实验原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液；大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤)；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液3.实验操作向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化管 号1234567材 料（滴）鸡蛋清溶液4指甲少许头发少许0.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）244040444现象三、蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应一）蛋白质的盐析作用1.实验原理盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出盐 析作用与两种因素有关：① 蛋白质分子被浓盐脱水；② 分子所带电荷被中和蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（ 称取377 g硫酸铵溶于20℃500ml 的蒸馏水中。
硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）3.实验操作取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白二）重金属盐类沉淀蛋白质1.实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04 溶液；3％AgNO3 溶液3.实验操作取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml，向各管分别滴加 2-3滴加 5％CuS04 溶液、3％AgNO3 溶液，观察各管所生成的沉淀在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5％CuS04 溶液，观察沉淀的溶解。
三）有机酸沉淀蛋白质1.实验原理生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱性物质凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等当蛋白质溶液 pH 值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；10％三氯醋酸溶液； 3.实验操作取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象思考题 1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因2．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？3．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量【实验目的】 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量实验试剂和器材】1.仪器 电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂2.试剂 （1）标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
3）鸡蛋清1ml定容至50mL【实验步骤】1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂 管号 试剂012345100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸馏水／mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液／mL5.05.05.05.05.05.0蛋白质含量/µg020406080100加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线2、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量实验结果】根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（µg），按下式计算： 查得的蛋白质含量（µg）×提取液总体积（mL）样品蛋白质含量（µg/g鲜重）= 样品鲜重（g）×测定时取用的提取液体积（mL） 【注意事项】 （1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
比色反应需在1h内完成2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净实验三 氨基酸的分离鉴定－纸层析法【实验目的】通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法实验原理】层析法又称色谱法1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的通常用α表示分配系数α=一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离显然两个物质的分。
