其它有机酸发酵工艺苹果酸.ppt

第四章第四章 其他有机酸发酵工艺学其他有机酸发酵工艺学 4.2苹果酸的发酵生产苹果酸的发酵生产 4.2.1概述概述 4.2.2苹果酸的性质以及用途苹果酸的性质以及用途 4.2.3苹果酸的生产方法苹果酸的生产方法 4.2.4苹果酸的提取和精制工艺苹果酸的提取和精制工艺 4.2.1概述概述 ?L-苹果酸苹果酸(L-malic acid简称简称L-Ma)是生物体是生物体糖代谢过程中产生的重要有机酸，广泛存在糖代谢过程中产生的重要有机酸，广泛存在于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃等的水果和蔬菜中含量约为等的水果和蔬菜中含量约为0.4% ?苹果酸发酵研究历史苹果酸发酵研究历史 ?我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作 ?苹果酸发酵生产的现状苹果酸发酵生产的现状 苹果酸发酵研究历史 ?早在早在20世纪世纪20代代Kostychev等利用蔗糖发酵等利用蔗糖发酵时，在加时，在加CaCO3的培养基中就获得了的培养基中就获得了L-苹果苹果酸 ?1959年阿部重雄等普查了年阿部重雄等普查了260株曲霉、株曲霉、120株株青霉和青霉和80株根霉的产苹果酸能力，选出了黄株根霉的产苹果酸能力，选出了黄曲霉曲霉A-114菌株，并对此菌株进行发酵条件菌株，并对此菌株进行发酵条件的探索。

摇瓶发酵的探索摇瓶发酵7～～9d、产苹果酸最高浓、产苹果酸最高浓度可达度可达50g/L ??1976年米光英一，利用出芽短梗霉年米光英一，利用出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans）可直接由糖质）可直接由糖质原料生产原料生产L-苹果酸 例如由葡萄糖例如由葡萄糖50g、、NaNO3 2.0g、、KH2PO4 1.5g、、MgSO4·7H2O 0.05g、酵母膏、酵母膏0.05g，，水水1.0L配成培养基、灭菌冷却后，接种出芽配成培养基、灭菌冷却后，接种出芽短梗霉，同时加短梗霉，同时加CaCO3 2%，，27℃℃振荡培养振荡培养5d，，1.0L培养基中含培养基中含L-苹果酸苹果酸25.2g ?酶催化法生产苹果酸酶催化法生产苹果酸 ?日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料，通过日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料，通过产氯杆菌菌体固定化，将富马酸转化成产氯杆菌菌体固定化，将富马酸转化成 L-苹果酸 ?1972年，千火田一郎等，以产氨短杆菌为生产菌株，年，千火田一郎等，以产氨短杆菌为生产菌株，以聚丙烯酰胺凝胶为载体进行菌体固定化连续生产以聚丙烯酰胺凝胶为载体进行菌体固定化连续生产L-苹果酸。

苹果酸 ?但利用此菌种进行反应过程中，副产物琥珀酸很难与但利用此菌种进行反应过程中，副产物琥珀酸很难与L-苹果酸分开苹果酸分开,经过反复试经过反复试验，用含验，用含脱氧胆酸脱氧胆酸或或胆酸胆酸的基质溶液进行处理，可抑制副产物琥珀酸的生成的基质溶液进行处理，可抑制副产物琥珀酸的生成提高了提高了L-苹果酸的产量在工业生产上选择了最廉价的胆汁为胆酸抑制副产苹果酸的产量在工业生产上选择了最廉价的胆汁为胆酸抑制副产物琥珀酸的生成物琥珀酸的生成 ?1974年田边制药公司以此法进行年田边制药公司以此法进行 L-苹果酸连续生产苹果酸连续生产在容积在容积1000L的充填塔中，日夜连续反应，日产的充填塔中，日夜连续反应，日产 L-苹果酸苹果酸15.4吨 ?1987年 Chikata、Ichiro等建立了一个1000L的以K-卡拉胶固定黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)的固定化反应柱，持续6个月，每小时能生产42.2Kg/L苹果酸 ?1990年 Fialovo、Marie等建立了一个中试车间，用藻朊酸固定棒杆菌细胞、流加富马酸盐溶液，每90d生产20吨苹果酸 ?田道制药公司和三菱化成公司用此工艺大量生产L-苹果酸。

产品主要用于医药工业的大输液、pH调节剂和某些药物的中间体 我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作 ?中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母(Candida rugosa)的苹果酸生产技术的苹果酸生产技术 ?福建省三明真菌研究所研究了福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体发酵苹果酸的霉菌固体发酵 ?1981年起无锡轻工大学金其荣等，普查了年起无锡轻工大学金其荣等，普查了261株各种曲霉的株各种曲霉的苹果酸生产能力，并对菌种进行了诱变处理和发酵最佳条件苹果酸生产能力，并对菌种进行了诱变处理和发酵最佳条件的探讨，选出了优良菌株黄曲霉的探讨，选出了优良菌株黄曲霉(Aspergillus flavus)UVT3，，并在昆山味精厂协作下完成了并在昆山味精厂协作下完成了500L罐中试，产率稳定在罐中试，产率稳定在68%左右 ?1991年吴梧桐用年吴梧桐用K-卡拉胶固定黄色短杆菌胶，用卡拉胶固定黄色短杆菌胶，用0.3mol/L KCl作固化剂，胆汁酸作激活剂、半衰期为作固化剂，胆汁酸作激活剂、半衰期为200d 以富马酸钠为底物，反应生成以富马酸钠为底物，反应生成L-苹果酸钠和剩余的富马酸钠。

苹果酸钠和剩余的富马酸钠利用苹果酸钙溶解度比富马酸钙低的特性，将利用苹果酸钙溶解度比富马酸钙低的特性，将L-苹果酸从混苹果酸从混合液中分离出来合液中分离出来 L-苹果酸生产现状 ???????目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等，世界总产量每年目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等，世界总产量每年约为约为10万吨，万吨， 其中其中L-苹果酸产量每年约为苹果酸产量每年约为4万吨，而世界市场潜在需求量达到每年万吨，而世界市场潜在需求量达到每年6万万吨，日本是世界主要的吨，日本是世界主要的L-苹果酸生产国与出口国苹果酸生产国与出口国 主要生产厂商：日本扶桑化学公司，美国主要生产厂商：日本扶桑化学公司，美国Denka化学公司，加拿大化学公司，加拿大Batek化学公司以及英国、南非等，但这些公司是用化学合成法生产，化学公司以及英国、南非等，但这些公司是用化学合成法生产，产品为产品为DL-苹果酸，每吨售价苹果酸，每吨售价2.4-3.0万元人民币万元人民币 日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力之之60%。

由于由于D-苹果酸不能被人体所利用，因此苹果酸不能被人体所利用，因此DL-苹果酸的消费市场将受到限苹果酸的消费市场将受到限制 1988年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为4%．到．到1991年上升到年上升到4.5%但由于苹果酸的价格太高，故只用于特殊食品一步发酵法一旦大规模但由于苹果酸的价格太高，故只用于特殊食品一步发酵法一旦大规模投产，的价格将会有大幅度地下降投产，的价格将会有大幅度地下降 1997年年Bayer公司称，美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，将减少柠檬公司称，美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，将减少柠檬酸用量，增加酸用量，增加L-苹果酸用量，尤其在使用二肽甜味剂时更能突出苹果酸用量，尤其在使用二肽甜味剂时更能突出L苹果苹果酸风味，改善口感，提高产品质量酸风味，改善口感，提高产品质量 ????? 目前我国的目前我国的L-苹果酸产量仅为苹果酸产量仅为1万吨左右万吨左右 主要企业有：主要企业有： 常茂生物化学工程股份有限公司（产量常茂生物化学工程股份有限公司（产量3000吨），南京国海生物工程有限公司（产量吨），南京国海生物工程有限公司（产量1000吨），吨）， 滦南九州生物化工有限公司（产量滦南九州生物化工有限公司（产量1000吨）。

吨） 产量上还远落后于国外同行企业，可见市场产量上还远落后于国外同行企业，可见市场发展空间之大发展空间之大 4.2.2苹果酸的性质以及用途苹果酸的性质以及用途 ??????????4.2.2.1苹果酸的性质苹果酸的性质 苹果酸又名苹果酸又名羟基丁二酸羟基丁二酸或或羟基琥珀酸羟基琥珀酸 性状：无色结晶，易吸潮性状：无色结晶，易吸潮 相对密度相对密度(d420)1.595熔点约130℃℃，沸点，沸点150℃℃(分分解解) 易溶于水，易溶于水，1g本品能溶于本品能溶于l.4mL醇、醇、1.7mL醚、醚、0.7mL甲醇、甲醇、2.3mL丙醇、几乎不溶于苯丙醇、几乎不溶于苯 具有酸味．结晶体，在水中具有旋光性具有酸味．结晶体，在水中具有旋光性 分子中含有一个不对称碳原子，故有分子中含有一个不对称碳原子，故有 L-、、D-、、DL型型3种 分子式：分子式：C4H6O5 HO-CH-COOH ∣∣ CH2-COOH 化学性质化学性质 ?苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%????香豆酸(2-吡喃酮-5-羧酸 )。

苹果酸的水溶液在Fe2+催化下与H2O2反应生成草酰乙酸 苹果酸在三氯化硼催化下，可与醇发生酯化反应，形成苹果酸酯 与多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚树脂 苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺 ???4.2.2.2苹果酸的用途苹果酸的用途 苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业???和工业也有应用和工业也有应用 苹果酸在食品行业的应用：苹果酸在食品行业的应用： （（1）苹果酸具有明显的呈味作用，其酸味柔和、）苹果酸具有明显的呈味作用，其酸味柔和、爽快，与柠檬酸相比刺激性缓慢、保留时间长，具爽快，与柠檬酸相比刺激性缓慢、保留时间长，具有特殊的香味，并且不损伤口腔和牙齿等特点有特殊的香味，并且不损伤口腔和牙齿等特点 （（2）苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜）苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲酯）（天冬氨酰苯丙氨酸甲酯） 配合使用，作为软配合使用，作为软饮料的风味固定剂饮料的风味固定剂 (3) 苹果酸在医学方面的作用：苹果酸在医学方面的作用： 由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用。

恢复体力的作用  ①①、、 由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料 ?②②、、 代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解，促进代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解，促进食物在人体内吸收代谢，低热量，可有效地防止肥胖，可以食物在人体内吸收代谢，低热量，可有效地防止肥胖，可以起到减肥的作用起到减肥的作用 ?③③、、 在药物中添加苹果酸可增加其稳定性，促进药物在人在药物中添加苹果酸可增加其稳定性，促进药物在人体的吸收、扩散；复合氨基酸输液生产中就是利用体的吸收、扩散；复合氨基酸输液生产中就是利用L-苹果酸苹果酸这一功能而用它来调节这一功能而用它来调节pH值的，同时作为混合氨基酸输液值的，同时作为混合氨基酸输液组分之一，可提高氨基酸利用率，用于治疗尿毒症、高血压组分之一，可提高氨基酸利用率，用于治疗尿毒症、高血压等和减少抗癌药物对正常细胞的侵害，用于癌症放、化疗后等和减少抗癌药物对正常细胞的侵害，用于癌症放、化疗后的辅助药物，用于烧伤治疗可以促进伤口愈合。

的辅助药物，用于烧伤治疗可以促进伤口愈合 ?④④、、 L-苹果酸可以促进氨代谢，降低血氨浓度，对肝脏有苹果酸可以促进氨代谢，降低血氨浓度，对肝脏有保护作用，是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能保护作用，是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良药障碍导致的高血氨症的良药 ? ?⑤⑤、、 L-苹果酸作为治疗心脏病基础液成分之一，用苹果酸作为治疗心脏病基础液成分之一，用于于K+ 、、Mg2+的补充，保持心肌的能量代谢，对心的补充，保持心肌的能量代谢，对心肌梗塞的缺血性心肌层起到保护作用肌梗塞的缺血性心肌层起到保护作用 ?⑥⑥、、 L-苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂，也可作为苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂，也可作为抗癌药的前体及用作动物生长促进剂抗癌药的前体及用作动物生长促进剂 ?⑦⑦、抗牙垢，苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味、抗牙垢，苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味独特及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱，相应的牙釉独特及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱，相应的牙釉质磨损体积损失较小，有不损害口腔和牙齿等特点质磨损体积损失较小，有不损害口腔和牙齿等特点 ?⑧⑧、可以改善脑组织的能量代谢、可以改善脑组织的能量代谢 ,调整脑内神经递质调整脑内神经递质 ,有利于学习记忆功能的恢复，对学习有利于学习记忆功能的恢复，对学习 记忆有明显的记忆有明显的改善作用改善作用 ?其他行业的应用：其他行业的应用： ?苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂，苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂，广泛用于染料工业；广泛用于染料工业； ?用由于用由于pH值调节，因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清值调节，因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、洁剂、焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、空气清洁剂和除臭剂，特别是清除室内鱼腥臭、香烟臭及食空气清洁剂和除臭剂，特别是清除室内鱼腥臭、香烟臭及食品贮藏室的异味，品贮藏室的异味， ?代替柠檬酸作为各种金属表面或容器的除锈剂。

代替柠檬酸作为各种金属表面或容器的除锈剂 ?苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体，用苹果酸聚合可合成苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体，用苹果酸聚合可合成生物降解塑料，有利于环境保护；生物降解塑料，有利于环境保护； ?在建材行业，苹果酸添加在水泥中，可缩短凝固时间，防止在建材行业，苹果酸添加在水泥中，可缩短凝固时间，防止碱性聚合反应发生，提高混凝土的强度，碱性聚合反应发生，提高混凝土的强度， ?代替草酸作为各种石块的表面清洗剂，使其表面变得光滑、代替草酸作为各种石块的表面清洗剂，使其表面变得光滑、平整、美观；平整、美观； ?苹果酸还可作为饲料添加剂，改善汽车排气质量或应用于海苹果酸还可作为饲料添加剂，改善汽车排气质量或应用于海带养殖业带养殖业 4.2.3苹果酸的生产方法苹果酸的生产方法 ?目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法?????主要有：一步发酵法，二步发酵法，固定化主要有：一步发酵法，二步发酵法，固定化细胞或酶法转化细胞或酶法转化 4.2.3.1一步发酵法一步发酵法 （（1）一步发酵法产苹果酸菌种的选育）一步发酵法产苹果酸菌种的选育 （（2）一步发酵法发酵工艺与条件）一步发酵法发酵工艺与条件 4.2.3.2二步发酵法二步发酵法 4.2.3.3固定化细胞或酶法固定化细胞或酶法 4.2.3.1一步发酵法 （1）一步发酵法产苹果酸菌种的选育 ?直接发酵法主要采用的微生物是：黄曲霉、直接发酵法主要采用的微生物是：黄曲霉、米曲霉米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉、寄生曲霉(Asp.parasiticus)、出芽短梗霉、出芽短梗霉(Aureabasidium pullulans)等。

等 ?特点：三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一特点：三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累果酸得以积累 （2）一步发酵法发酵工艺与条件 一步发酵法又称直接发酵法，即采用一种微生一步发酵法又称直接发酵法，即采用一种微生物直接发酵糖质原料或非糖质原料（如正构烷物直接发酵糖质原料或非糖质原料（如正构烷烃）生成烃）生成L-苹果酸的方法以糖类为原料，由苹果酸的方法以糖类为原料，由黄曲霉、米曲霉等直接发酵生产苹果酸黄曲霉、米曲霉等直接发酵生产苹果酸 这些微生物最大的特点就是三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累 ? 金其荣等选出的黄曲霉金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种，经诱变剂联合处理后经，获得株菌种，经诱变剂联合处理后经，获得株 产酸较稳定产酸较稳定的菌种的菌种TH5007可用薯干粉经可用薯干粉经α-淀粉酶液化后作初糖进行发酵，而在发酵中间淀粉酶液化后作初糖进行发酵，而在发酵中间 加入葡萄糖，使总糖达到加入葡萄糖，使总糖达到13%，发酵产，发酵产L-苹果酸达苹果酸达7.33%，扣除杂酸，对糖转化，扣除杂酸，对糖转化率为率为56.4%，发酵强度，发酵强度1g／／(L．．h)的结果。

的结果 ?刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产刘建军等人从土壤中分离出几株直接利用糖质原料生产L-苹果酸的黄曲霉菌株，苹果酸的黄曲霉菌株，经紫外线、亚硝基胍经紫外线、亚硝基胍 ,Co60,硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离，硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板分离，获得一株获得一株L-苹果酸高产突变株黄曲霉苹果酸高产突变株黄曲霉HA5800，以，以100g/L的葡萄糖为碳源的葡萄糖为碳源, 35℃℃ , 200r/min摇瓶发酵摇瓶发酵120h,L-苹果酸产率稳定在苹果酸产率稳定在72g/L以上，糖酸转化率达以上，糖酸转化率达74.23%传代实验证明该菌株产酸性能稳定传代实验证明该菌株产酸性能稳定 ?吴清平等人以曲霉菌吴清平等人以曲霉菌LMO2为出发株，选育出为出发株，选育出Nl-14、、NEUl2、、Nul416和和Nul419 其中其中N1-14菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源，最大发酵体积为菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源，最大发酵体积为20m3，发，发酵酵120h产产L苹果酸酸苹果酸酸85.8g／／L并己取得了中国专利并己取得了中国专利(CN1112160)。

?以色列以色列Battat 等人报道黄曲霉等人报道黄曲霉(ATCC13697)以葡萄糖为碳源，以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，升发酵罐发酵，以葡萄糖为碳源，以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，通过条件优化培养升发酵罐发酵，通过条件优化培养190小时，产酸高达小时，产酸高达11.3% 控制条件控制条件 ?①①生孢斜面培养基：生孢斜面培养基： 麦芽汁琼脂斜面麦芽汁琼脂斜面 ?②②锥形瓶培养基：锥形瓶培养基： 麦芽汁，麦芽汁，33℃℃静止培养静止培养2～～4d ?③③种子培养基种子培养基(g/L)：：葡萄糖 30，豆饼粉 10， K2HPO4·3H20 0.2， MgSO4·7H2O 0.1， NaCl 0.01， FeSO4·7H2O 0.5，CaCO3 60(单独灭菌)，MnSO4·H2O 1.2 ?④④发酵培养基采用葡萄糖发酵培养基采用葡萄糖70～～80g/L，其余成分与种子培养，其余成分与种子培养基相同 ?种子培养基分别加入种子罐补足水量，加入泡敌种子培养基分别加入种子罐补足水量，加入泡敌(50L培养基培养基加入加入20ml)抑制泡沫生成并缓慢搅拌，抑制泡沫生成。

并缓慢搅拌，0.1MPa实罐灭菌实罐灭菌20～～30min，冷却至，冷却至35℃℃左右加入已灭菌的左右加入已灭菌的CaCO3，并接，并接种黄曲霉锥形瓶种子，在种黄曲霉锥形瓶种子，在33～～34℃℃，，180r/min搅拌培养、搅拌培养、通气量通气量0.15～～0.3vvm，培养，培养18～～20h后接入发酵罐发酵罐后接入发酵罐发酵罐培养基配制同上法培养基配制同上法, 灭菌后降温至灭菌后降温至34℃℃时，接入时，接入10%种子培种子培养液，通气搅拌进行发酵发酵时控制温度养液，通气搅拌进行发酵发酵时控制温度33～～34℃℃，通，通气量气量0.7vvm，搅拌转速，搅拌转速180r/min，自动流加泡敌控制泡沫，自动流加泡敌控制泡沫生成，发酵周期约生成，发酵周期约40h待残糖降到待残糖降到1.0g/L时，放罐提取时，放罐提取 ?????????金其荣使用薯干粉液化为金其荣使用薯干粉液化为碳源碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工序，，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工序，有利于降低生产成本有利于降低生产成本 薯干粉液化液分批发酵，不补加糖，发现初糖浓度薯干粉液化液分批发酵，不补加糖，发现初糖浓度9.7%时产酸最高。

时产酸最高 初糖浓度过高或过低，都不利于发酵产酸和转化率初糖浓度过高或过低，都不利于发酵产酸和转化率 吴清平等筛出的曲霉菌诱变株吴清平等筛出的曲霉菌诱变株N1-14也具有糖化酶活力，也可以淀粉液也具有糖化酶活力，也可以淀粉液化液为碳源发酵生产化液为碳源发酵生产L-苹果酸 不同菌种对不同菌种对氮源氮源的要求不同的要求不同 例如金其荣等用的氮源对产例如金其荣等用的氮源对产L-苹果酸的影响研究中，无机氮源，苹果酸的影响研究中，无机氮源，NaNO3 和和NH4NO3不利于产酸不利于产酸0.5%豆饼粉效果较好，且较为经济豆饼粉效果较好，且较为经济 豆饼粉用量为豆饼粉用量为0.3-0.5%,产产L-苹果酸最为理想，发酵液中总酸达苹果酸最为理想，发酵液中总酸达7.0%左左右玉米粉中也含有一定量的氮源，而且玉米粉中也含有右玉米粉中也含有一定量的氮源，而且玉米粉中也含有 65%左右的淀左右的淀粉 玉米粉用量低于玉米粉用量低于0.5%时，对产酸不利一般采用时，对产酸不利一般采用1.0%-1.5%玉米粉，此玉米粉，此时也可扣除初糖的用量时也可扣除初糖的用量 无机盐无机盐成分经实验证明，成分经实验证明，K2HPO4,KH2PO4,FeSO4,MgSO4,MsSO4等对等对产酸有一定的影响。

在正交实验中，用高压液相色谱进行分析时，初步产酸有一定的影响在正交实验中，用高压液相色谱进行分析时，初步认为认为KH2PO4和和K2HPO4浓度为浓度为0.015%-0.02%，以，以0.015%时为最佳时为最佳表表8.2.6列出了列出了N1-14菌种菌种20m3发酵罐数据发酵罐数据 4.2.3.2二步发酵法 ?二步发酵法即采用两种不同功能的微生物， ?其中之一先将糖质或其他原料转化生成富马酸（延胡索酸）， ?另一种微生物将富马酸转化成L-苹果酸 ?二步发酵法，由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率相对较低，副产物较多 ?蒋明珠蒋明珠等从等从41株根霉属菌株中选出产富马酸能力最株根霉属菌株中选出产富马酸能力最高，同时产生部分高，同时产生部分 L-苹果酸的菌株苹果酸的菌株 R25，经鉴定为，经鉴定为无根根霉（无根根霉（Rhizopus arrhizus ））, ?再用具有高富马酸酶活力的普通变形杆菌再用具有高富马酸酶活力的普通变形杆菌（（Proteeas vulgaris））P1.可将富马酸转化为可将富马酸转化为 L-苹苹果酸 ?无根根霉菌株无根根霉菌株 R25在含有在含有12g/dL葡萄糖的培养基葡萄糖的培养基中中,31℃℃培养培养3天，完成了富马酸的发酵。

然后将在天，完成了富马酸的发酵然后将在液体培养基中液体培养基中31℃℃培养培养2天的普通变形杆菌天的普通变形杆菌 P1 接入，接入，在同样的条件下发酵在同样的条件下发酵 2天，天，L-苹果酸的产量可达苹果酸的产量可达5.48g/dL ?在含有在含有18g/dL薯干粉培养基中发酵，能得到相同的薯干粉培养基中发酵，能得到相同的产量，产物经分离提纯为白色结晶，经纸色谱，红产量，产物经分离提纯为白色结晶，经纸色谱，红外光谱鉴定为苹果酸外光谱鉴定为苹果酸 ?华侨大学的胡纯铿等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培养发酵L-苹果酸，分别探讨碳源浓度对A-23菌株和V-81菌株发酵水平的影响 ?实验表明，A-23菌株产延胡索酸能力强V-81菌株具有高活性的延胡索酸酶， ?研究A-23菌株和V-81菌株混合培养方式对发酵L-苹果酸的影响， ?结果表明A-23菌株接入含有150g/L葡萄糖的混合发酵培养基中培养3d,后接入V-81菌株并继续培养2天，产酸水平最高，L-苹果酸浓度达73.3g/L,对糖的转化率达65.6%  3N1-14菌种20m 发酵罐数据 4.2.3.3固定化细胞或酶法 ?利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用固定化酶或细胞反应器，将富马酸转化成L-苹果酸。

?虽然固定化细胞和固定化酶均有应用，但由于酶的提取技术复杂，收率不高，成本昂贵，因而在实际生产中多用固定化细胞 ?采用的载体主要有藻酸钙凝胶，角叉菜胶及聚丙烯酰氨凝胶等 ?有富马酸酶活力的菌种有：产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes ），黄色短杆菌（Brevibacterium flavum ），假单胞杆菌（Pseudomonas fumarase ），膜噗毕赤酵母（Pichia membranaefaciens ），皱褶假丝酵母（Candidarugose），马棒杆菌（Corynebacterium equi），大肠杆菌（E.coli），普通变形杆菌（Proteeas vulgaris ），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和八叠球菌（Sarcina varihils）含有较高活性富马酸酶的微生物有短杆菌，产氨短杆菌，黄气短杆菌，解脂假丝酵母和温特曲霉等 ?黄腾华和王雪根，以黄腾华和王雪根，以 富马酸铵为酶反应底物富马酸铵为酶反应底物 ，选用，选用黄色短杆菌黄色短杆菌，在，在16L发酵罐中培养发酵罐中培养20h，酶活力达，酶活力达到到40000单位。

单位 ?12L发酵液得到的菌体制成容积为发酵液得到的菌体制成容积为 16L的固定化细的固定化细胞，取其中胞，取其中8L装成反应柱，在装成反应柱，在37℃℃每天流过每天流过14%的的富马酸铵溶液富马酸铵溶液100L，可产，可产L-苹果酸苹果酸12.5%，质量转，质量转化率近化率近89.29% ?杨廉婉等人以富马酸为原料采用固定化细胞的方法杨廉婉等人以富马酸为原料采用固定化细胞的方法生产苹果酸将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠生产苹果酸将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠岩粉吸附再用聚乙烯醇包埋，低温固定化固定化岩粉吸附再用聚乙烯醇包埋，低温固定化固定化细胞的富马酸酶回收率细胞的富马酸酶回收率 90%以上，产物对底物的转以上，产物对底物的转化率化率80%以上91103606 专利）专利） ???? 西德专利西德专利2450137公布了用聚丙烯酰胺凝胶公布了用聚丙烯酰胺凝胶包埋产延胡索酸酶的微生物细胞生产苹果酸包埋产延胡索酸酶的微生物细胞生产苹果酸的方法 Yamamoto 等也报道了用相似的办法固定化等也报道了用相似的办法固定化产氨短杆菌连续生产苹果酸的方法产氨短杆菌连续生产苹果酸的方法 Takata 报道了用卡拉胶包埋黄色短杆菌连续报道了用卡拉胶包埋黄色短杆菌连续生产苹果酸的方法。

生产苹果酸的方法 中国专利中国专利92107642也描述了用卡拉胶包埋黄也描述了用卡拉胶包埋黄色短杆菌生产苹果酸的方法色短杆菌生产苹果酸的方法 ?该方法的劣势：该方法的劣势： ?生产成本较高生产成本较高 ?以化学合成原料富马酸生产的苹果酸存有疑虑，以化学合成原料富马酸生产的苹果酸存有疑虑， ?从混合液中把苹果酸和富马酸彻底分开难度较大，产品质量从混合液中把苹果酸和富马酸彻底分开难度较大，产品质量?????很难达到出口要求很难达到出口要求 所以这种方法生产苹果酸也具有一定的局限性所以这种方法生产苹果酸也具有一定的局限性 该方法实施现状该方法实施现状 日本自二十世纪日本自二十世纪70年代开始使用这种工艺小批量生产年代开始使用这种工艺小批量生产L-苹果苹果酸，但发展不快，产量至今不大酸，但发展不快，产量至今不大 我国八十年代末九十年代初，固定化酶或细胞转化法生产我国八十年代末九十年代初，固定化酶或细胞转化法生产L-苹果酸的研究达到了高潮，全国各地相继建设了多条生产线，苹果酸的研究达到了高潮，全国各地相继建设了多条生产线， 但由于固定化酶的转化率低，半衰期短，国产富马酸质量不但由于固定化酶的转化率低，半衰期短，国产富马酸质量不稳定，生产成本相对较高，稳定，生产成本相对较高， ?对该方法的研究对该方法的研究: ?固定化细胞酶活力稳定性的研究 ?固定化方法的选择， ?主要包括固定介质，细胞浓度， ?胆汁酸和胆氧胆酸浓度， ?温度，底物浓度和pH值等因素。

⑴固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸流程 ?此工艺一般包括两步： ?一是固定化细胞的制备：将产酶菌株培养成熟后，收集菌体细胞，包埋菌体，制备固定化酶或细胞， ?通常在37℃条件下运行，转化半衰期可达 160天左右； ?二是L-苹果酸制备：先将富马酸和CaCO3反应转化为富马酸钙，经提取得L-苹果酸 ?目前这种方法生产苹果酸的转化率可达98%以上， ?⑵斜面培养基 普通肉膏琼脂培养基 ?⑶摇瓶种子培养基(g/dL) ?柠檬酸二胺2.0～3.0, 玉米浆2.0～4.0, ????KH2PO4· 3H2O 0.2 ，MgSO4·7H2O 0.05 ， 尿素0.2，pH 7.0，0.1MPa灭菌20min ⑷发酵培养基(g/dL) 葡萄糖1.5，玉米浆1.5，富马酸0.4， KH2PO4· 3H2O 0.1, MgSO4·7H2O 0.05, 尿素0.2, pH 6.7～7.0,0.1 MPa灭菌20min ?⑸发酵过程 ? 30℃℃ 30℃℃ ?肉膏斜面菌种活化肉膏斜面菌种活化 30℃℃ 16～～24h 少量无菌水洗下转接至克氏少量无菌水洗下转接至克氏 30℃℃ 瓶肉膏琼脂表面上瓶肉膏琼脂表面上 24h ?无菌水洗下无菌水洗下 1000ml摇瓶摇瓶(内装内装300ml摇瓶培养基摇瓶培养基) 摇床摇床16～～24h ? 发酵罐发酵罐 每隔每隔2～～4h取样测定。

取样测定 12h ⑹⑹收集活菌体收集活菌体 发酵结束后经发酵结束后经16000rpm 离心离心15min，， 生理盐水洗涤活菌体生理盐水洗涤活菌体2次，每次洗涤离心次，每次洗涤离心15min，， 发酵液中菌体浓度为发酵液中菌体浓度为3%～～4%，每次，每次1g温菌体的酶活力为温菌体的酶活力为2.0～～2.5万单位  ?⑺⑺菌体包埋菌体包埋 ?以以8g湿菌体加湿菌体加8ml生理盐水将菌体制成悬浮液生理盐水将菌体制成悬浮液,放在温水浴内放在温水浴内,加温使品加温使品温达温达40～～45℃℃备用 ?取取1.5gK-卡拉胶加卡拉胶加34ml蒸馏水，放在蒸馏水，放在70～～80℃℃热水浴中搅拌，待卡拉热水浴中搅拌，待卡拉胶充分溶胀后，慢慢冷却至品温胶充分溶胀后，慢慢冷却至品温45℃℃，， ?立即将保温的细胞悬浮液，迅速倒入卡拉胶液中立即将保温的细胞悬浮液，迅速倒入卡拉胶液中,不断搅拌不断搅拌10min，等其，等其冷却成型，冷却成型， ?放置放置2～～10℃℃冰箱中，冰箱中，2h后取出，后取出， ?用用0.3mol/L KCl浸泡浸泡4h，再切成，再切成3××3××3mm3小块，整个操作在无菌条小块，整个操作在无菌条件下进行。

件下进行 ?所得固定化细胞加入所得固定化细胞加入15ml由由1mol/L富马酸钠内含富马酸钠内含0.3%的胆酸组成的活的胆酸组成的活化液，在化液，在37℃℃下保温下保温20～～24h进行活化，进行活化， ?其目的是激活富马酸的活力并抑制琥珀酸副产物的产生其目的是激活富马酸的活力并抑制琥珀酸副产物的产生 ?活化后的固定化细胞颗粒用活化后的固定化细胞颗粒用0.1mol/L KCl洗涤洗涤2～～3次，再用无离子水洗次，再用无离子水洗至无胆酸为止，装柱待用至无胆酸为止，装柱待用 ?⑻⑻上柱前的准备及酶转化上柱前的准备及酶转化 ?工业级富马酸加工业级富马酸加NaOH配制成配制成1∶∶1mol/L的富马酸钠溶液，的富马酸钠溶液，pH7.0保温保温37～～40℃℃，， ?然后将溶液上柱转化将底物溶液以恒速流过装有固定化细然后将溶液上柱转化将底物溶液以恒速流过装有固定化细胞的反应柱胞的反应柱, 底物通过富马酸酶转化成底物通过富马酸酶转化成L-苹果酸 ?流出液中流出液中L-苹果酸钠浓度以苹果酸钠浓度以0.85mol/L为标准，为标准， ?大于此值可适当加快流速流出液中已转化好的大于此值可适当加快流速。

流出液中已转化好的L-苹果酸钠苹果酸钠占大部分占大部分,在整个反应过程中底物和柱的温度要始终保持在在整个反应过程中底物和柱的温度要始终保持在37～～40℃℃ ?至于固定化细胞内酶活力的半衰期，据报导与菌种、固定化至于固定化细胞内酶活力的半衰期，据报导与菌种、固定化材料、工艺操作等因素有关材料、工艺操作等因素有关, 据王博彦、金其荣研究据王博彦、金其荣研究, 观察观察6个月未见个月未见L-苹果酸产率下降的现象苹果酸产率下降的现象 ?1972年千火田年千火田 一郎用聚丙烯酰胺包埋产氨短杆菌制成固定一郎用聚丙烯酰胺包埋产氨短杆菌制成固定化细胞，装入充填柱内进行连续反应生产化细胞，装入充填柱内进行连续反应生产L-苹果酸苹果酸,算出在算出在37℃℃时酶活力的半衰期为时酶活力的半衰期为52.5d 4.2.4苹果酸的提取和精制工艺苹果酸的提取和精制工艺 ?苹果酸的提纯： ?钙盐沉淀法、吸附沉淀法、电渗析法 ?钙盐沉淀法：钙盐沉淀法包括转化，过滤，酸解，过滤，净化，浓缩，结晶，干燥等，流程 钙盐沉淀法工艺流程钙盐沉淀法工艺流程 ??溶剂萃取法：近年来人们有提出了一种从水溶液中提取苹果溶剂萃取法：近年来人们有提出了一种从水溶液中提取苹果酸的工艺流程。

该法以酸的工艺流程该法以TRPO（三烷基氧化瞵）为萃取剂，（三烷基氧化瞵）为萃取剂，以煤油为稀释剂的萃取体系于常温下进行萃取，然后再用以煤油为稀释剂的萃取体系于常温下进行萃取，然后再用去离子水进行反萃，反萃温度为去离子水进行反萃，反萃温度为60℃℃,萃取率为萃取率为80%，， 去离子水排出反萃脱色蒸发结晶成晶萃取相25°C苹果酸水溶液萃取有机相：40%TRPO+60%煤油苹果酸精制 ?采用离子交换和活性炭联合处理，进行除杂质和脱采用离子交换和活性炭联合处理，进行除杂质和脱??????色 滤清液送入高位槽，进入酸性阳离子交换柱，再进滤清液送入高位槽，进入酸性阳离子交换柱，再进入弱碱性阳离子交换柱进行脱盐处理；入弱碱性阳离子交换柱进行脱盐处理； 再把净化液引入真空浓缩罐中，在再把净化液引入真空浓缩罐中，在 50～～70℃℃下浓缩下浓缩至至1000～～1300g/L，， 然后放入结晶罐中缓缓搅拌降温至然后放入结晶罐中缓缓搅拌降温至 5～～20℃℃，加入，加入晶种，晶种， 待晶体成长完成后，用离心机分出晶体，待晶体成长完成后，用离心机分出晶体， 用少量无盐水洗去晶面母液，用少量无盐水洗去晶面母液， 收集湿晶收集湿晶,放入沸腾干燥床上，用放入沸腾干燥床上，用 30～～60℃℃的干燥的干燥空气干燥，干燥后的空气干燥，干燥后的 L-苹果酸经质检合格后即行包苹果酸经质检合格后即行包装贮存。

装贮存 4.2.5苹果酸的检测和标准苹果酸的检测和标准 ??????????苹果酸生产相关的检测技术主要 : 4.2.5.1富马酸酶活力的测定 4.2.5.2苹果酸检测方法 ⑴定性检验 ⑵定量测定 ⑶富马酸定量检测 ①高锰酸钾滴定法 ②紫外分光光度法 ③高效液相色谱法 4.2.5.3苹果酸的质量标准 4.2.5.1富马酸酶活力的测定 ?1.富马酸酶活力的测定富马酸酶活力的测定 ?酶活力的含义即每毫升发酵液或每克湿菌体每小时消耗富马酶活力的含义即每毫升发酵液或每克湿菌体每小时消耗富马????????酸的毫克数，即单位活力酸的毫克数，即单位活力mg/(h.ml)或或mg/(h.g ) 2、测定方法：、测定方法： 取取2ml发酵液发酵液,8000rpm离心，去清液，用生理盐水洗涤活菌离心，去清液，用生理盐水洗涤活菌体，离心体，离心,再去清液再去清液 将活菌体置于将活菌体置于37℃℃水浴中保温水浴中保温5～～10min 准确吸取准确吸取3ml在在37℃℃水浴中保温的底物水浴中保温的底物(1mol/L富马酸钠含富马酸钠含0.04% 十六烷基溴化三钾铵，十六烷基溴化三钾铵，50mmol/L KH2PO4· 3H2O，，pH7.0)，， 加入装有菌体的小试管中，于加入装有菌体的小试管中，于37℃℃水浴中搅拌水浴中搅拌15min，， 立即将反应试管放于沸水中加热立即将反应试管放于沸水中加热5min，中止反应。

中止反应 离心取上清液，转入容量瓶中，离心取上清液，转入容量瓶中， 测富马酸含量测富马酸含量(从标准曲线上查出富马酸含量，然后根据活从标准曲线上查出富马酸含量，然后根据活力单位含义算出扩大培养液每力单位含义算出扩大培养液每1ml酶活力酶活力)用培养时间作横用培养时间作横坐标坐标(h),用酶活力单位作纵坐标，画出产富马酸酶曲线图用酶活力单位作纵坐标，画出产富马酸酶曲线图 ?⑴定性检验 ?采用显色反应即称取样品 1g，溶于20ml水中，吸4.2.5.2苹果酸检测方法 1ml此液放于15ml试管中，用氨水(分析纯)中和，用量0.05～0.1ml,切勿过量， ?加入1%对氨基苯磺酸水溶液，在沸水浴中加热5min，再加入20%亚硝基钠溶液5ml，稍加热后，以4%NaOH溶液调pH至碱性，此液应呈红色，表明有苹果酸存在； ?另外还有三氯化钛法，即在试管中加入 5ml待试溶液，滴入3滴15%三氯化钛溶液，几分钟后，出现白色沉淀，表明有苹果酸存在 ?若气温过低，可稍加热，此法对苹果酸最低检出浓度为0.5g/L ⑵定量测定 酸碱滴定法酸碱滴定法 ?即准确称取样品即准确称取样品1.5g放于放于250ml容量瓶中，溶解后定容。

容量瓶中，溶解后定容 ?准确吸取此溶液准确吸取此溶液25.0ml放于三角瓶中，加入放于三角瓶中，加入2滴酚指示剂，滴酚指示剂，用用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色溶液滴定至微红色(持续时间不得少于持续时间不得少于30s)每毫升0.1mol/L NaOH溶液相当于溶液相当于6.704mg苹果酸 紫外分光度法紫外分光度法, ?即取即取1ml样品溶液样品溶液(苹果酸浓度控制在苹果酸浓度控制在0.05～～0.8mg/L)，放入，放入试管中，加入试管中，加入6ml硫酸（分析纯），加入硫酸（分析纯），加入0.1ml 2，，7-萘二酚萘二酚溶液，在溶液，在100℃℃水浴中加热水浴中加热12～～15min，冷却至接近室温后，，冷却至接近室温后，在在385nm处进行比色测定，以蒸馏水作对照，校正仪器零点处进行比色测定，以蒸馏水作对照，校正仪器零点 ?用标准样品先制作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，用标准样品先制作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即处吸收值即OD385为纵坐标通过未知样品在为纵坐标通过未知样品在385nm处的处的OD值，则可在标准曲线上找到相应的苹果酸浓值，则可在标准曲线上找到相应的苹果酸浓度。

度 ??即准确称取1～2g待测样品，置于50ml锥形瓶内，⑶富马酸定量检测 ①高锰酸钾滴定法 ????加2ml蒸馏水，使样品溶解后加 1滴浓硫酸(分析纯)，然后用0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定，滴定速度为每3s 1滴，从开始出现红色持续 4s不褪色即终点记下耗用高锰酸钾升数，查标准曲线，就可计算出富马酸含量 m1 富马酸含量= —×100% m2 式中m1为标准曲线上查得的富马酸克数， m2为样品质量 ?②②紫外分光光度法紫外分光光度法 ?准确称取准确称取1～～2g待测样品，用待测样品，用0.2mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH7.0)准确配制准确配制10mg/ml浓度的待测液，准确吸浓度的待测液，准确吸取取1ml待测液，在待测液，在280nm紫外光测定，记下吸光度紫外光测定，记下吸光度值值A280nm，可以从标准曲线上查到富马酸含量可以从标准曲线上查到富马酸含量 ③③高效液相色谱法高效液相色谱法 ?现对苹果酸质量控制越来越高，要求 99%以上都是苹果酸，富马酸残留量要求在 0.5%以内，对检验手段也要求很高。

?高效液相色谱就是利用高分辨树脂层析，在同一流动相中将富马酸、苹果酸和其他有机酸很好地分开它们在210nm紫外检测器中，可以记录出峰的顺序，而且系列稳定，可以重复 ?具体操作：分别配制标准苹果酸、富马酸等 10%标准溶液，分别注入一定量于树脂柱中，用洗脱液洗出，记录各标样出峰时间和相应的峰值，如带计算机的还可用峰的积分面积计算 3.苹果酸的质量标准 ?苹果酸及其相关项目的检验方法可参照美国药典(1995年23版P22d2、P22)的规定进行 ?苹果酸的质量指标见下表。