waters日常维护及操作.ppt

Waters2695-2489 HPLC系统,HPLC日常维护及实验操作,开机及准备系统,开机自检,准备流动相,灌注柱塞密封清洗,灌注针头清洗,检查真空脱气机状态,执行干灌注,执行湿灌注,冲洗进样器,设定流动相平衡色谱柱,放入样品盘,管路是否已干,是,否,开机自检,打开Alliance 2695和2489 的电源开关至 ON 的位置，仪器开始进行自检 2. 仪器将进行大约5分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，画面上方的状态显示区会出现“Idle” 状态，表示开机测试正常色谱柱对流动相的要求,除去微粒 使用0.45μm或更细的膜过滤 酸碱性较强的流动相应注意对滤膜的腐蚀作用 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内（一般为pH2-8） 缓冲液（盐）的浓度(≤100mM) 有机溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量,液相色谱对流动相的要求,必须用色谱纯有机溶剂 — 室温下密封,避光保存 水或缓冲盐溶液要用超纯水(18.2MΩ) 缓冲盐流动相: — 当日现配现用 — 低温下密封保存,一般不超过3天 — 最好加5%有机溶剂混合保存,液相色谱对流动相的要求,有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: — 低温密封保存 — 防止有机相的挥发 避免用含卤素离子的缓冲液（如：碘化锂、氯化钾等） 选用适宜的容器 —玻璃容器必须使用超纯水清洗,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm,保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm,流动相的脱气目的,— 使色谱泵的输液准确 o 输液量均匀准确，并且脉动减小 o 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 — 提高检测的性能 o 防止气泡引起的尖峰 o 基线稳定，信噪比增加 o 溶剂的紫外吸收本底降低 — 保护色谱柱 o 减少死体积 o 防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。

但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果一般超声时间不要太长(1分钟左右即可) 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度,,流动相更换,用水更换色谱系统中缓冲液，将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，并用水进行灌注，将管路中的旧流动相替换，然后插入新的流动相中 用新流动相更换水或冲洗色谱柱溶剂 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡（正反相系统变换时一般用异丙醇过渡）,Waters溶剂瓶注意事项,检查6根管子是否在液面下，必须确保6根管子全部插到溶剂瓶的底部 溶剂瓶液面必须高于溶剂混合阀的位置；而洗针液的溶剂瓶应放于试验台面上，与2695仪器底部位于同一水平面上,,灌注柱塞密封清洗,,主界面中，选择Diag 按Prime Seal Wash ，再按Start 直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，按Halt 4. 按Close 密封圈清洗的溶液，在反相液相色谱中 可使用90％水/10％甲醇 (体积比，根据 实际需要进行选择)灌注针头清洗,主界面中，选择Diag。

按Prime Ndl Wash，缺省设定值为30 秒，若想要多清洗几次时，请按Start Again 洗针溶液，在反相液相色谱中可使 用50％水/50％甲醇 (体积比，根据实 际需要进行选择)干灌注和湿灌注,,按主机上的“Menu/Status” 键，进入Status界面检查真空脱气机degasser的模式mode是否为on一般为on） 当溶剂的管子是空的时候，或不小心走干溶剂的时候执行干灌注 (Dry Prime) 当需要排除气泡时，或平时更换流动相时执行湿灌注 (Wet Prime) 干灌注 (Dry Prime),,,1.将空的针筒插入抽液阀（排液阀）中，打开抽液阀(以逆时针的方向将抽液阀旋2-3圈) 2.按“Menu/Status” 键，进入Status (1)画面，按“Direct Function” 功能键，选择Dry Prime，按Enter 3.按下欲使用的溶剂开启阀门(例如:Open A)，然后将针筒向外拉，抽出约5~10mL溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡，完成后关闭排液阀排液阀不要拧太紧，以不漏液为准湿灌注 (Wet Prime),1.将欲Wet Prime 的溶剂比例输入100% 2.按“Direct Function” 功能键，选择Wet Prime，按Enter。

Wet Prime 的设定值，一般为Flow : 5mL/min，Time: 2.0min， 然后按下“OK” 键，泵即开始进行Wet Prime 操作真空脱气机为 状态时，流速不要超过5ml/min） 3. 重复上述的步骤直到对所有溶剂的Wet Prime执行完毕 注意事项：若有缓冲盐流动相,灌注前用后均需用水过渡,,冲洗进样器 (Purge Injector),何时执行？ ○ 改变溶剂时 ○ 发现注射器及其管路内有气泡时 ○ 每天开机和关机的时候 1.按“Direct Function” 键，选择Purge Injector，按Enter 2.输入Sample Loop 体积清洗的倍数(原定值为6 倍)，按Enter冲洗进样器,每次进样前仪器会洗针（Needles wash）进样之后不洗针 进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗 每次批量进完样后手动清洗 或最后进一针50μl流动相 如果流动相中有盐的话则用水替代缓冲盐那部分比例,液相色谱对样品(包括标样)制备的要求,— 必须能溶于流动相 如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱 — 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 — 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用,样品预处理常用的方法,高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract,SPE ) — Oasis和Sep-Pak固相提取小柱 其它,色谱柱安装及连接的机械因素,,,谱带展宽,连接适当,连接不妥，造成漏液,连接不妥,色谱泵,色谱泵运行 注意∶ 排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如∶进样器、色谱柱 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中,色谱泵,使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高,要适当调整压力,一般压力上限在3500-4000Psi 注意防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧坏电机。

液相色谱系统的清洗与钝化,色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂 先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜,色谱泵及系统的清洗,清洗液用30%磷酸水溶液 30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀 清洗步骤如下: — 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 — 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) — 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟(四元泵的 A,B,C,D四路各为25%) — 换成清水洗至出口水pH显中性 — 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,色谱泵及系统的钝化,钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下:,— 在清洗步骤完成后进行钝化处理 — 确认清洗用的磷酸已基本洗净 — 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) — 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 — 换成清水洗至出口水pH显中性 — 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用,紫外检测器,保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗； 使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内； 检测器灯有一定寿命，超过4小时不用时可以不开灯； 尽量避免使用pH9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞。

HPLC常见故障分析,能引起HPLC发生问题的潜在因素: 工作环境 电源及地线 流动相 泵 进样器 保护柱 过滤器 连接管路 色谱柱 检测器 数据处理装置 操作,逻辑判断及处理,问题 化学品 环境 仪器 *色谱柱/保护柱 *电源 *泵 *流动相 *地线 *进样器 *样品 *温度 *检测器 *湿度 *数据处理单元 *清洁程度 从最简单,容易之处入手: 如 1.停止流速; 2.去掉柱子;,HPLC系统压力问题分析,问题:系统压力高 可能的原因: —温度太低 —流速太高 —流动相粘度大 —管路堵塞 —仪器或色谱柱堵塞 —压力传感器问题,HPLC系统压力问题分析,问题:压力低或没有压力 可能原因: —温度太高;流速太低 —泵关闭或保险丝断了 —泵未输送流动相 —系统内有渗漏处 —所用溶剂不正确 —自动进样器在Purge时卡住,HPLC系统压力问题分析,问题:压力低或没有压力 可能原因:（续） —储液瓶中无溶剂 —低压限设置不当 —泵未正确排气 —溶剂入口过滤头堵 —入口管路中有空气 —泵失效,HPLC系统压力问题分析,问题:压力不稳 可能原因: —压力传感器问题 —泵排气不充分 —泵失效 —流动相未正确脱气 —所用溶剂不混溶或易挥发,,过滤器,单向阀,吸滤头,HPLC系统压力问题分析,单向阀的清洗如果使用过缓冲盐溶液请使用40 ℃ ~50℃的温水超声20min 如果使用过纯乙腈请使用异丙醇超声20min 如果使用过其他流动相或上述两种溶液超声后请使用纯甲醇超声20min,HPLC流路基线噪音问题分析,基线不稳定(不重复),—检测池中有大的气泡 —流路中有小气泡流过 —系统未稳定或未达到化学平衡 —流动相被污染 —检测器流动池漏 —色谱柱污染,HPLC流路基线噪音问题分析,基线漂移,色谱柱有其他组份被洗脱出 - 冲洗, 直至基线稳定 溶剂发生变化 (如溶入气体或溶剂挥发) - 氦气或脱气机脱气, 溶剂瓶避光,密封(但要注意防止溶剂瓶内产生负压) 系统有漏液之处 - 检漏并处理 环境温度影响 (尤其对示差,电导,电化学检测) - 室温,柱温,检测池温度控制 环境湿度影响 对光检测器有较大影响 反压变化 - 溶剂和样品过滤. 注意黏度过大的样品,HPLC流路基线噪音问题分析,基线周期性噪声,绝大多数情况下是来源于泵的问题 泵头内有气泡 - 流动相脱气 ,泵头排气 泵进出口阀有问题 - 更换单向阀组件 柱塞杆有问题 - 更换柱塞杆及其密封圈 溶剂混合不良 - 加装混合器 电噪声 - 去除噪声源,HPLC流路基线噪音问题分析,非周期性噪声,气泡 - 流动相脱气 检测池内有气泡 - 流动相脱气, 检测池后加适当反压 系统有漏液之处 - 检漏并处理 溶剂混合不良 - 加装混合器 电噪声 - 去除噪声源,HPLC流路基线噪音问题分析,基线周期性波动,温度影响 - 环境温度及检测池温度控制. 注意空调的影响 溶剂混合不良 - 加装混合器 流动相脱气不良 - 流动相脱气 供电电源的影响 泵不良 – 检修泵,HPLC流路基线噪音问题分析,基线有无规律的尖峰,气泡 - 溶剂脱气 电路接触不良 - 保证清洁, 接线牢固, 接点无氧化 光源灯不良- 检查。