对链霉素的发酵制备和理化性质检测的独立研究.doc

对链霉素的发酵制备和理化性质检测的独立研究研究目的：链 霉 素 （ streptomycin） 由 灰 色 链 霉 菌 发 酵 生 产 双 氢 链 霉 素 可由 湿 链 霉 菌 产 生 ， 但 通 常 以 半 合 成 方 法 生 产 链霉素抗菌谱较广，对结核菌具有强大的制菌作用，其作用机理是主要与原核细胞(如细菌)核糖体 30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡所以研究灰色链霉菌的生长状况和制备链霉素有着重要的意义本实验主要进行链霉素的发酵制备及过程中相关理化性质的检测，以熟悉链霉素发酵的整个过程和把握其发酵过程的条件控制研究方法：一、简介1942年 Waksman从放线菌中分离出了链霉素并开发成为在临床使用的第二个抗生素它给当时被认为不治之病的结核病人带来了福音以链霉素的发现为起点，从放线菌中陆续发现了金霉素、土霉素、四环素等四环类抗生素，苄那霉素、庆大霉素、新霉素、妥布霉素、小诺霉素等氨基糖苷类抗生素，红霉素、吉他霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等大环内酯抗生素，利福霉素等安莎类抗生素，制霉菌素、两性霉素 B等多烯类抗霉菌抗生素似乎临床常见的传染病都能医治，从而形成了抗生素的黄金时代。

我国 1956年投产了金霉素，1958 年投产了链霉素，除此之外还从细菌产物中分离了多粘菌素、杆菌肽等肽类抗生素80％的抗生素来自于放线菌目前我国生产的这类天然抗生素已达 30种，从一个国家来说是世界上生产品种最多、产量最大的国家链 霉 素 由 灰 色 链 霉 菌 发 酵 生 产 双 氢 链 霉 素 可 由 湿 链 霉 菌 产 生 ， 但 通 常以 半 合 成 方 法 生 产 由 灰 色 链 霉 菌 产 生 的 广 谱 抗 生 素 ， 分 子 由 链 霉 胍 、 链霉 糖 和 N－ 甲 基 -L-葡 萄 糖 胺 组 成 链 霉 素 分 子 中 链 霉 糖 部 分 的 醛 基 被 还 原成 伯 醇 基 后 ， 就 成 为 双 氢 链 霉 素 ， 其 抗 菌 效 能 与 链 霉 素 大 致 相 同 ， 但 对 听 觉神 经 的 毒 性 比 链 霉 素 大 链霉素抗菌谱较广，对结核菌具有强大的制菌作用，进入体内后主要分布在细胞外液，对细胞外旺盛繁殖的结核菌有杀菌作用，对细胞内的细菌无效，故称它为半个杀菌药链 霉素是典型的次级代谢产物，其发酵的特点之一就是分批过程分为菌体的生长期、产物期和菌体期三个阶段。

灰色链霉菌的生长和链霉素的生物合成受到许多发酵条件的影响：温度、发酵 pH值、溶氧、接种量、泡沫等同时还受到一些代谢调控机制的控制：磷酸盐的调节作用、分解代谢产物调节和产生菌生长速率的调节等链霉素的作用机理是主要与原核细胞(如 细菌)核糖体 30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡由 于 链 霉 素肌 肉 注 射 的 疼 痛 反 应 比 较 小 ， 适 宜 临 床 使 用 ， 只 要 应 用 对 象 选 择 得 当 ， 剂 量又 比 较 合 适 ， 大 部 分 病 人 可 以 长 期 注 射 （ 一 般 2 个 月 左 右 ） 所 以 ， 应 用数 十 年 来 它 仍 是 抗 结 核 治 疗 中 的 主 要 用 药 所以研究灰色链霉菌的生长状况和制备链霉素有着重要的意义二、仪器与材料（一）培养基1、斜面高氏一号培养基可溶性淀粉 2% 氯化钠 0.05% 硝酸钾 0.1% 三水磷酸氢二钾 0.05% 七水硫酸镁 0.05% 七水硫酸亚铁 0.001% 琼脂 1.5%-2.0% pH：7.4-7.62、种子培养基可溶性淀粉 3% 玉米蛋白粉 0.5% 碳酸钙 2.0% 玉米浆 3.5% pH：7.0-7.53、发酵培养基葡萄糖 4.0%，玉米淀粉 3.5%，玉米浆 2.0%，玉米蛋白粉 3.0%,NH4C1 0.5%，NaCl1.5%，CaCO 3 1.5%，泡敌 0.05%，pH 7.0-7.2（二）实验菌种：灰色链霉菌，微生物实验室保藏（三）仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤等三、实验步骤1．斜面孢子的制备无菌条件下，从冷藏的产生菌的斜面孢子中，刮取适量孢子涂在高氏斜面上，然后置 36.5～37℃的恒温箱培养 3天，再置 30℃的恒温室培养 1天。

2．种子的制备（1）摇瓶种子培养基的配制 按种子培养基成分配比，配制培养基，包装灭菌2）接种在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种铲挖块约 2cm2，接种于灭过菌的摇瓶种子培养基中3）培养将接种好的种子摇瓶于 30℃恒温室摇床上，转速为 230转/分，培养 28小时左右3．发酵罐发酵(3L/5L、20L/30L)（1） 发酵培养基的配制以发酵培养基配方为基础，按设定体积配制发酵培养基(先定容至 15L)，将除 CaCO3和泡敌之外的物料加入罐中，加热至 80℃-90℃糊化 25min，降温至28℃用 NaOH调节 pH至 7.0-7.2再 121℃灭菌 20min,冷却后补入无菌水至 20L左右2）火焰保护接种在发酵罐接种口，将培养 28小时-30 小时的摇瓶种子以 10%接种于发酵罐中3）培养将接种后的发酵罐于 33℃恒温培养 10天，转速为 230转/分4）发酵样的测定：全程需补入灭过菌的水来控体积每天需取样测定 pH、总糖、菌浓(湿重和干重)等指标，见后发酵 60h后开始每天取样测效价发酵过程可能出现泡沫，需准备灭过菌的泡敌，适时补加泡敌防止逃液4. 第 10天放罐，测定发酵液体积，用四层纱布过滤并洗涤，将菌丝体转移至干净的搪瓷杯中，调节菌浓 15%,喷雾干燥。

5. 链霉素效价检测方法(1)样品处理A．发酵液浸提处理：称取 2g混匀后发酵液加丙酮浸提液 9ml，超声40min，8000r/min 离心 5min，取上清备用若效价较高，可用0.1mol/L,pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液 进行一定稀释B．丙酮浸提液：丙酮：1mol/L HCl：水=490ml：48ml：462ml，再用1mol/L HCl调节 pH至 1.8-2.32）液相（HPLC）检测柱子：Gemini C18（4.6×250mm,5μm,Phenomenex）洗脱液: 乙腈:50mM KH 2PO4=30%:70%, pH 4.5流速: 1.0ml/min检测波长: 267nm根据比对标准品的峰面积，计算效价四、实验方法1. DNS法测定链霉素发酵过程中总糖和还原糖1.1 DNS法原理 DNS法即 3，5-二硝基水杨酸比色法的简称其原理是 3，5-一二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物-3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比 1.2 DNS试剂的配制溶液 A，称分析纯氢氧化钠 104g 溶于 1300ml水中，加入 30g分析纯3，5-二硝基水杨酸。

溶液 B，称分析纯酒石酸钾钠 910g，溶于 2500ml水中，再称取 25g重蒸苯酚和 25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液将 A、B 溶液混合，加入 1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用 1.3 标准葡萄糖溶液的配制（1mg/ml）称取 105℃干燥至恒重（2h）的葡萄糖对照标准品 100mg，定容配成 100ml溶液1.4 DNS标准曲线制做DNS标准曲线（3,5-二硝基水杨酸法）：二硝基水杨酸测定还原糖(DNS)法以0.1mg/ml葡萄糖标准液绘制标准曲线，检测波长为540nm葡萄糖标准曲线制作：取7支25ml具塞刻度试管编号，按表2.2分别加入浓度为1 mg/ml葡萄糖标准液、蒸馏水、3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5分钟，取出，流水冷却至室温，并用蒸馏水定容至10ml并塞上塞子后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色调波长540nm，用0号管调零点，测定其光密度值以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标作图绘制标准曲线标准曲线要求：R 2>0.99以上然后根据发酵上清液的盐酸水解液进行一定稀释，然后按上述方法与DNS溶液混合，按上述方法测定定容好的混合液的OD值，根据OD值和稀释倍数计算发酵液中的总糖含量。

1.3.5 盐酸用量对链霉素发酵液总糖的影响取待测样品 10ml，分别加入 10ml、15ml、20ml 的 6mol/ L的盐酸，于沸水浴加热 30min，冷却，再以 6mol/L的氢氧化钠中和，定容至 100ml，过滤，稀释按上述方法进行还原糖的测定 2、发酵液中氨态氮含量的测定 2.1 测定原理 采用甲醛滴定法测定利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点2.2 测定步骤 吸取5.0 mL样品，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0 mL，置于200 mL烧杯中，加 60 mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.050 mol/L]滴定至酸度计指示pH=8.2 ，记下消耗体积V 1，加入10.0 mL甲醛溶液，混匀再用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH=9.2，记下消耗体积为V 2，同时做试剂空白试验，记消耗体积为V 02.3 计算公式 X=[（V 2- V1- V0）*C 1*0.014]*100/(5*V3/1000) （3-1）；式中：X1-样品中氨基酸态氮的含量，g/L； V1-测定用样品稀释液加入甲醛前消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2-测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V0-试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL； V3-样品稀释液取用量，mL； C1-氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L； 0.014-与1.0 mL NaOH标准滴定液[c(NaOH)=1.0 mol/L]相当的氮的质量，g。

c(NaOH)=0.050 mol/L，使用前需要标定3、喷雾干燥使用说明3.1 将各部件安装好 3.2 连接电源，按下绿色启动按钮，显示界面（一） ，点击触摸屏上任何一个地方进入界面（二） ；3.3 点即手动画面进入手动工作，点击参数设置A 风机设定：点击数值框，弹出数字键盘，按 clr键将数字清零，然后输入所需值，按 ENTER键修改完成（一般设定值在 48-55） 65，提高风力B 通针设定：数值代表几秒钟启动一次，设定同上（一般为 10-20）C 蠕动泵设定：同上（一般设定值在 50-65）D进风温度设定：同上（一般设定值在 200-230）3.4 参数设置结束，点击自动工作进入界面四，点击右上角停止中，设备进入程序自动控制3.5 温度到达所设温度后，将进料管放入物料中喷料3.6 料喷完后，将进料管换至清水中，待料管中的料逐渐变清，从水中提出料管，直至料管中的水喷完，点击右上角 运行中 按钮，结束本次试验或手动停机步骤A 料喷完后，进清水将管内物料全部顶出，关闭蠕动泵；B 关闭加热器； C 关闭空压机；D 待进风温度降至 90度以下，关闭风机3.7 取下集料瓶，收集物料；3.8 容器完全冷却后取下清洗；3.9 拆开雾化器彻底清洗，为下次试验做准备五、研究结果与分析（一） 实验结果原始数据记录1. 葡萄糖标准曲线绘制表一、葡萄糖标准曲线制作管号 1 mg/ml葡萄糖浓度（ml） 蒸馏水（ml） DNS（ ml） OD值0 0.。