长链非编码RNASNHG16靶向miR-16-5p调控胃癌细胞增殖、凋亡的机制.docx

长链非编码RNASNHG16靶向miR-16-5p调控胃癌细胞增殖、凋亡的机制胃癌发病率高居世界第二位,死亡率在恶性肿瘤中居第三位[1,2],5年生存率低于50%,且预后较差[3]因此,研究胃癌发生和转移的分子机制,寻找潜在的诊断治疗靶点,已成为胃癌分子诊断和治疗基础研究领域的热点研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)在多种肿瘤组织和细胞中表达异常,参与肿瘤发生发展的全过程[4,5,6]小核内RNA宿主基因(SNHG)16是位于人类17号染色体17q25.1上的lncRNA,首次发现于神经母细胞中,作为癌基因在神经母细胞瘤中表达上调,与患者不良预后有关[7]后来研究发现,SNHG16在结直肠癌和膀胱癌中也表达上调,与肿瘤的迁移和侵袭过程密切相关[8,9]SNHG16在胃癌组织中表达上调,表达水平与胃癌细胞的侵袭有关[10]miRNA在胃癌组织和细胞中作为癌基因或抑癌因子,参与癌细胞的增殖、侵袭、迁移等过程miR-16-5p在多种肿瘤组织或细胞中表达下调或缺失,与癌细胞的凋亡有关[11,12]胃癌细胞中miR-16-5p表达下调,可以作为胃癌早期筛查和进展评价的潜在标志物[13]。

miR-16-5p和SNHG16在胃癌增殖凋亡中都具有重要作用,而两者是否存在某种调控关系,尚不清楚本文拟研究SNHG16影响胃癌MGC-803细胞增殖、凋亡的分子机制,探寻miR-16-5p在此过程中的作用1、材料与方法1.1材料人胃癌细胞株MGC-803和人正常胃上皮细胞株GES-1购自ATCC;高糖DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司;miR-16-5pmimics(miR-16-5p)、inhibitor(anti-miR-16-5p)、si-SNHG16购自广州锐博生物;双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司;Trizol试剂、real-timePCR试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)、Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司;流式细胞仪和试剂盒购自美国BD公司;光学显微镜、全自动酶标仪及real-timePCR仪购自美国Bio-Rad公司1.2细胞培养MGC-803细胞用高糖DMEM培养液培养,培养液中添加10%FBS+100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素,在37℃5%CO2培养箱中培养,湿度95%。

待细胞生长至对数生长期时,洗涤消化收集细胞进行后续实验1.3细胞转染将培养至对数生长期的MGC-803细胞,用培养液稀释细胞浓度至1×106个/mL,将稀释细胞以200μl/孔接种于6孔板中,细胞培养至融合度达到80%～90%时进行转染用无血清OptiMEM培养液稀释Lipofectamine2000、si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-16-5p、pcDNA、pcDNA-SNHG16、si-SNHG16+anti-miR-NC、si-SNHG16+anti-miR-16-5p、WT-SNHG16+miR-NC、WT-SNHG16+miR-16-5p、MUT-SNHG16+miR-NC和MUT-SNHG16+miR-16-5p的载体,之后取等体积原生质体与等体积各组载体混合,轻柔混匀后室温孵育20min,加入培养好的细胞孔板中,混匀后继续培养,6h后换成完全培养基,转染48h后收集细胞进行后续实验1.4Real-timePCR检测mRNA表达将各组转染后的MGC-803细胞培养48h(si-NC组、si-SNHG16组、miR-NC组、miR-16-5p组、pcDNA组和pcDNA-SNHG16组),Trizol提取总RNA,保存于-80℃。

然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA,反应程序为16℃30min、42℃45min、72℃5min;4℃放置10min,合成的cDNA测定浓度和纯度后-80℃保存按照real-timePCR说明书取cDNA进行反应,反应程序为:95℃10min;95℃42s、58℃35s、72℃45s,42个循环;72℃10min引物如下:miR-16-5p上游:5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′,下游:5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′;miR-16-5pmimics(miR-16-5p)序列:5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′,anti-miR-16-5p序列:5′-CACCAAUAUUUACGUGCUGCUA-3′;SNHG16上游:5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′,下游:5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′;si-SNHG16序列:5′-GGAAUGAAGCAACUGAGAUUU-3′运用IQ5TM系统(Bio-Rad)进行数据分析1.5MTT实验测定细胞活性转染48h后,收集MGC-803细胞,Trypsin消化细胞,用培养液调整细胞浓度为1×104个/ml,2×103个细胞/孔接种于96微孔板中,继续培养,分别在24、48、72h进行MTT实验,每孔加入20μl(5mg/ml)MTT,继续培养4h,弃上清,每孔加入150μlDMSO,室温振荡5min,酶标仪测定OD490nm处的吸光度(A)值。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡率将转染后的各组MGC-803细胞(si-NC组、miR-16-5p组、si-NC组、si-SNHG16组、miR-16-5p+pcDNA组和miR-16-5p+pcDNA-SNHG16组)培养至对数生长期,接种于6孔板中,继续培养48h,收集细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,根据膜联蛋白V/碘化丙啶(AnnexinV/PI)kit说明书操作,用100μl标记缓冲液重悬细胞,然后加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI,室温避光15min,用流式细胞仪检测分析细胞凋亡率1.7双萤光素酶报告系统实验胰蛋白酶消化转染48h后的MGC-803细胞,计数,以1×104个细胞/孔接种于24孔板中,继续培养24h,观察若细胞融合为一层,则进行转染,分别构建SNHG16的野生型(WT-SNHG16)和突变型(MUT-SNHG16)双荧光素酶报告载体,然后分别共转染miR-NC或miR-16-5p,转染后培养48h,收集细胞,加入裂解缓冲液,室温裂解20min,离心收集上清,加入荧光素酶底物,发光仪检测荧光素酶活性以海肾荧光素酶活性为内参照,计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.8统计学处理采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析2、结果2.1lncRNASNHG16和miR-16-5p在胃癌MGC-803细胞和胃上皮GES-1细胞中的表达qRT-PCR结果表明,与人正常胃上皮细胞GES-1组(0.98±0.09、1.29±0.11)相比,在胃癌细胞MGC-803组中SNHG16的表达量(2.04±0.17)显著升高(P<0.05),而miR-16-5p的表达量(0.56±0.06)显著下降(P<0.05)2.2抑制SNHG16表达可抑制胃癌MGC-803细胞增殖qRT-PCR结果表明,与si-NC组(1.92±0.18)相比,si-SNHG16组SNHG16表达量(0.63±0.09)显著下降(P<0.05)MTT实验结果表明,与si-NC组相比,si-SNHG16组细胞活性(OD490nm)在48h、72h均显著下降(P<0.05),见图1图1抑制SNHG16表达作用不同时间对胃癌MGC-803细胞增殖的影响与si-NC组比较:1)P<0.05,2)P<0.012.3抑制SNHG16表达可促进胃癌MGC-803细胞凋亡流式细胞术结果表明,与si-NC组(7.61%±1.13%)相比,si-SNHG16组MGC-803细胞凋亡率(22.49%±2.01%)显著增加(P<0.05),见图2。

图2抑制SNHG16表达对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响2.4SNHG16靶向调控miR-16-5p的表达Targetscan软件预测结果显示,SNHG16的序列中含有与miR-16-5p互补的核苷酸序列,见图3双荧光素酶报告系统结果显示,与miR-NC组(1.01±0.09,0.98±0.08)相比,miR-16-5p组野生型WT-SNHG16(0.41±0.06)显著下降(P<0.05),而突变型MUT-SNHG16的萤火虫荧光素酶相对活性(1.03±0.09)没有明显变化(P>0.05)qRT-PCR结果发现,与pcDNA组(0.54±0.05)相比,pcDNA-SNHG16组miR-16-5p表达量(0.23±0.02)显著下降(P<0.05);与si-NC组(0.51±0.06)相比,si-SNHG16组miR-16-5p表达量(1.13±0.08)显著上升(P<0.05)图3核苷酸序列2.5miR-16-5p过表达可抑制胃癌MGC-803细胞增殖、促进细胞凋亡qRT-PCR结果表明,与miR-NC组(0.57±0.07)相比,miR-16-5p组miR-16-5pRNA表达量(1.23±0.11)显著升高(P<0.05)。

MTT结果显示,在48h和72h时,与miR-NC组相比,miR-16-5p组MGC-803细胞活性显著下降(P<0.05),见图4流式细胞术结果显示,与miR-NC组(8.13%±0.09%)相比,miR-16-5p组MGC-803凋亡率(19.46%±2.04%)显著升高(P<0.05)图4过表达miR-16-5p作用不同时间对胃癌MGC-803细胞活性的影响图4过表达miR-16-5p作用不同时间对胃癌MGC-803细胞活性的影响下载原图与miR-NC组比较:1)P<0.052.6抑制miR-16-5p表达逆转了抑制SNHG16表达对胃癌MGC-803细胞增殖、凋亡的作用MTT结果显示,在48h和72h时,与si-NC组相比,si-SNHG16组MGC-803细胞活性显著下降(P<0.05);与si-SNHG16+anti-miR-NC组相比,si-SNHG16+anti-miR-16-5p组MGC-803细胞活性显著上升(P<0.05),见图5流式细胞术结果显示,与si-NC组(7.68%±0.83%)相比,si-SNHG16组MGC-803细胞凋亡率(21.49%±2.13%)显著上升(P<0.05);与si-SNHG16+anti-miR-NC组(23.26%±2.11%)相比,si-SNHG16+anti-miR-16-5p组MGC-803细胞凋亡(13.76%±1.57%)率显著下降(P<0.05)。

图5各组作用不同时间MGC-803细胞活性比较与si-NC组比较:1)P<0.05;与si-SNHG16+anti-miR-NC组比较:2)P<0.053、讨论胃癌是世界常见的第二大恶性肿瘤,全球每年因胃癌死亡约73万例,超过50%的新发病例发生在发展中国家,中国作为一个人口大国约占40%,癌细胞的转移导致胃癌患者5年生存率低于50%,在欧洲国家,生存率只有10%～30%,只有日本因早期检查和诊断技术的发展胃癌5年生存率达到90%[14,15]因此,研究胃癌的发病和发展机制,为胃癌的诊断和治疗提供新的方向具有重要意义研究表明,lncRNA参与多种肿瘤的发生和发展过程,多个lncRNA参与调控胃癌的转移[16]SNHG16于2009年被首次发现于人神经母细胞瘤,在结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织和细胞中出现异常表达,与肿瘤细胞。