阪崎肠杆菌检验课件.pptx

阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验 Enterobacter sakazakii(ES)Enterobacter sakazakii(ES)3内容内容第一部分：一般特征第一部分：一般特征第二部分：致病性第二部分：致病性第三部分：第三部分：ESES的检验的检验4第一部分：一般特征第一部分：一般特征1 1培养特征培养特征2 2生化反应生化反应3 3抵抗力抵抗力4 4增殖能力增殖能力与其他常与其他常见肠杆菌相似杆菌相似5一、培养特征一、培养特征 ESES在在VRBGAVRBGA平板上首次划线分离时，平板上首次划线分离时，3737培养培养24h24h可生成可生成2 2种不同的形态学特征：种不同的形态学特征：1.1.干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金金属环接触时可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复传代属环的菌量很少，并且菌落可很快恢复传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落培养后可能会转变为典型的光滑菌落2.2.光滑、易于用金属环从菌落移取细胞光滑、易于用金属环从菌落移取细胞国外文献报道国外文献报道6本实验室本实验室1.1.大多数分离株呈流蜡样，大多数分离株呈流蜡样，粉紫色、圆形、光滑、凸粉紫色、圆形、光滑、凸起、饱满，并散发出特殊起、饱满，并散发出特殊气味；气味；2.2.干燥、顶端发白的粉紫色干燥、顶端发白的粉紫色菌落；菌落；3.3.从配方粉中初次分离到的从配方粉中初次分离到的该菌在该菌在VRBGAVRBGA平板上过夜平板上过夜培养后呈现特殊的菌落形培养后呈现特殊的菌落形态：菌落干燥、边缘有褶态：菌落干燥、边缘有褶皱，极富弹性。

传代后，皱，极富弹性传代后，菌落皱褶减少，延长培养菌落皱褶减少，延长培养时间，可见皱褶逐渐增加时间，可见皱褶逐渐增加7二、生化反应二、生化反应 特征性生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落+-葡萄糖苷酶+8ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶KCN生长v发酵:蔗糖()卫矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黄色素()注：90-100；()：75-89%；V ：25-74；()：10-24；：0-99三、抵抗力三、抵抗力耐热性耐热性 渗透压渗透压干燥干燥 不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消巴氏消毒毒过程能有效的灭活过程能有效的灭活ESESES ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株，增加增加PIFPIF加工后污染的危险性，使其在加工后污染的危险性，使其在PIFPIF中长期存活中长期存活10四、增殖能力四、增殖能力 66，2121，3737分别是分别是13.7h13.7h，1.7h1.7h，191921min21min。

MRAMRA发现，与本底相比，发现，与本底相比，2525放置放置6h6h该菌的相对危险该菌的相对危险性可增加性可增加3030倍；倍；2525放置放置10h10h可增加可增加30 00030 000倍20042004年年2 2月月FAO/WHOFAO/WHO在日内瓦召开的在日内瓦召开的PIFPIF中中ESES专家研讨专家研讨会上提出会上提出PIFPIF中微量的中微量的ESES（3 CFU/100g3 CFU/100g3 CFU/100g3 CFU/100g）污染也能）污染也能导致感染的发生导致感染的发生11第二部分：致病性第二部分：致病性1 1易感人群易感人群2 2主要感染渠道主要感染渠道3 3配方粉中配方粉中ESES的污染状况的污染状况4 4PIFPIF中中ESES的来源及中毒发生的原因的来源及中毒发生的原因12一、易感人群一、易感人群婴儿：婴儿：1.1.脑膜炎脑膜炎2.2.坏死性小肠结肠炎坏死性小肠结肠炎3.3.菌血症菌血症严重的神经系统后遗症严重的神经系统后遗症高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出高危人群：主要是婴儿，新生儿、尤其是早产儿、低出生体重等生体重等免疫力低下免疫力低下的婴儿。

的婴儿死亡率：死亡率：50%50%，20-50%20-50%成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等成人：局部感染、菌血症、术后骨髓炎等13二、主要感染渠道二、主要感染渠道 ！乳品安全标准（报批稿）乳品安全标准（报批稿）婴儿配方食品婴儿配方食品特殊医学用途配方食品特殊医学用途配方食品0-6个月龄个月龄14三、配方粉中三、配方粉中ESES的污染状况的污染状况研究研究样品样品肠杆菌（肠杆菌（+）ES（+）菌种（菌种（%）Muytjens 等1980141（MPN/100g）75（51.8%）20（14.2%）E.agglomerans(24.8)E.cloacae(21.3)E.sakazakii(14.2)Iversen和Forsythe 200482（25g）7（8.5%）2（2.4%）Pantoea spp（2.4)E.cloacae(1.2)E.sakazakii(2.4)本试验室2006212（40g）103（48.58%）11（5.19%）Pantoea spp（11.32）E.cloacae（7.55）E.sakazakii（5.19）产品召回食品、环境广泛分布15四、四、PIFPIF中中ESES的来源及中毒发生的原因的来源及中毒发生的原因 目前公共卫生关注的目前公共卫生关注的PIFPIF中中ESES的来源包括以的来源包括以下下2 2种情况：种情况：内在污染内在污染 二次污染。

二次污染如：加工环境中微生物的存在；加工装置如：加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理后，与干燥基粉内表面微生物的存在；热处理后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物混合的加入成分中存在的微生物外源性污染外源性污染配方粉调制环境和调制器皿配方粉调制环境和调制器皿受受ESES污染的配方粉或调制配方在较高温度污染的配方粉或调制配方在较高温度下存放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食下存放，食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致时间较长等都可导致ESES有机会生长繁殖，增加有机会生长繁殖，增加患病的危险性患病的危险性16 PIF PIF中中ESES的安全性问题，已成为全球关注的焦点的安全性问题，已成为全球关注的焦点20022002年年ICMSFICMSF把把ESES列为列为“严重危害特殊人群，威胁严重危害特殊人群，威胁生命、导致慢性实质性后遗症或长期影响生命、导致慢性实质性后遗症或长期影响”的一的一种病原菌种病原菌20042004年年2 2月月FAO/WHOFAO/WHO在日内瓦召开的在日内瓦召开的PIFPIF中中ESES专家研专家研讨会：讨会：ESES列为列为PIFPIF中仅有的两种中仅有的两种A A类致病菌（沙门类致病菌（沙门和阪崎）之一。

和阪崎）之一17第三部分第三部分食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验本标准修改采用本标准修改采用1.ISO/TS 22964（1st edition 2006-02-01）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii2.FDA July 2002;Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 19第一法：阪崎肠杆菌的检验第一法：阪崎肠杆菌的检验第二法：阪崎肠杆菌的计数第二法：阪崎肠杆菌的计数20第一法第一法 阪崎肠杆菌的检验阪崎肠杆菌的检验21阪崎肠杆菌检验程序阪崎肠杆菌检验程序 报 告生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝绿色菌落1mL+mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g/mL+稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选择性增菌选择性分离生 化 鉴 定TSA251，48 h4h5.1 5.1 前增菌和增菌前增菌和增菌BPWBPW（合适时可选择无菌水合适时可选择无菌水）左图：未混合；左图：未混合；右图：混合后。

右图：混合后23mLST-VmmLST-Vm mLST-Vm mLST-Vm，即在大肠菌群增菌肉汤，即在大肠菌群增菌肉汤LSTLST中另加入中另加入适量的适量的NaClNaCl和和Vm Vm研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门菌属、大肠埃希氏菌等）相比，氏菌等）相比，ESES具有较高的耐渗透压能力加入具有较高的耐渗透压能力加入0.5 M 0.5 M 的的NaClNaCl在保证在保证ESES良好生长的同时，可以有效地抑制上述良好生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长其他细菌的生长VmVm可有效地抑制可有效地抑制G+G+菌的生长而较高的生长温度可以进菌的生长而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长一步抑制其他细菌的生长245.2 5.2 分离分离 显色培养基的基本原理相似，二者都显色培养基的基本原理相似，二者都是根据是根据ESES能产生能产生-葡萄糖苷酶，分解底物葡萄糖苷酶，分解底物XaGlcXaGlc产生有色菌落产生有色菌落25显色培养基对显色培养基对ESES的选择性较好，的选择性较好，ESES形成的特征性菌形成的特征性菌落易于辨认，以落易于辨认，以DFIDFI为例：为例：1.1.硫化氢指示剂可以区分硫化氢指示剂可以区分ESES和产生少量和产生少量-葡萄糖苷酶但葡萄糖苷酶但H2SH2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。

阳性菌株（如普通变形杆菌）2.2.ESES都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落都可以在该平板上生长并产生蓝绿色菌落3.3.其他常见菌在其他常见菌在DFIDFI平板的菌落颜色平板的菌落颜色a.a.白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等氏菌、泛菌属的多种菌等b.b.黄色菌落：赫氏埃希氏菌黄色菌落：赫氏埃希氏菌c.c.黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:ESIA:蓝蓝色，色，1-3mm1-3mm国产显色培养基国产显色培养基2636361124 h2h24 h2h27黄色素黄色素TSATSA：2525培养后培养后典型典型ESES：黄色：黄色阴性对照阴性对照E.coli E.coli ATCC 25922ATCC 25922：白色菌落：白色菌落285.3 鉴定（生化反应）鉴定（生化反应）生化试验特征黄色素产生氧化酶L-赖氨酸脱羧酶L-鸟氨酸脱羧酶（）L-精氨酸双水解酶柠檬酸水解()发酵：D-山梨醇（）L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙注：99%阳性；99%阴性；（）90%99%阳性；（）90%-99%阴性。

29商业生化鉴定系统的应用商业生化鉴定系统的应用推荐使用的推荐使用的ESES生化鉴定方法有很多，主要有生化鉴定方法有很多，主要有API 20EAPI 20E，ID 32EID 32E，Biolog GN2 MicroPlateBiolog GN2 MicroPlate，VITEK GNI+VITEK GNI+等上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用家和组织的标准采用在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API API 20E20E和和Vitek GNI+Vitek GNI+30API 20E生化鉴定板典型生化反应图示 API 20E反应编码API 2。