基因表达调控及重组DNA技术.ppt

第十三第十三 --- --- 十五章十五章基因表达调控及重组基因表达调控及重组DNADNA技术技术1主要内容主要内容Ø 基因及基因表达调控相关概念基因及基因表达调控相关概念Ø 原核基因表达调控基本原理原核基因表达调控基本原理Ø 真核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理Ø 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念Ø 重组重组DNADNA技术技术基本原理基本原理2 负载特定遗传信息的负载特定遗传信息的DNA片段，包括：片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列编码序列、非编码调节序列和内含子序列 基因基因 （（Gene））3基因组基因组（（Genome）） 来自一个遗传体系的一整套遗传信息来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个环状染色体所含的全部基因原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部真核：一个生物体的染色体所包含的全部 DNA，又称染色体基因组，又称染色体基因组线粒体基因组线粒体基因组叶绿体基因组叶绿体基因组4Human Genome5人类基因组计划人类基因组计划（（Human Genome Project, HGP）） 1985年美国提出年美国提出 计划投入计划投入30亿美元，亿美元，15年完成年完成 1990年正式启动年正式启动 英、法、德、日、中国等先后加入英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务：中国的任务： 人类人类3号染色体短臂上一个约号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序，区域的测序， 该区域约占人类整个基因组的该区域约占人类整个基因组的1％。

％61990年年10月月 启动启动19912000年年 6月月 完成草图完成草图19922001年年 2月月 《《nature》》公布草图公布草图 Nature, 409 (6822): 860-921, 2001Nature, 409 (6822): 860-921, 2001 2004年年 10月月 《《nature》》公布精度公布精度 > 99%的测序图的测序图 人类基因数：人类基因数：2 - 2.5万万 Nature, 431 (7011): 931-945, 2004Nature, 431 (7011): 931-945, 2004HGP的进展的进展The post-genome era is coming7谱主为生物学大师谱主为生物学大师耗资耗资200万完成万完成 盼未来降价普及盼未来降价普及 助提早预防疾病助提早预防疾病“ 生命天书生命天书” —— 首份个人基因图公布首份个人基因图公布 (2007.5.30) James Waston8 基因表达调控基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。

机制重组重组DNA技术技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系法，获得某一目的基因的无性繁殖系—DNA克隆，或使目克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理9第一节第一节 基因表达调控基因表达调控10一、基因表达的概念一、基因表达的概念* 在各种调节机制控制下，从基因激活开始，在各种调节机制控制下，从基因激活开始，经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的经历转录、翻译等过程产生具有生物学功能的蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，蛋白质分子，从而赋予细胞一定的功能或表型，或使生物体获得一定的遗传性状或使生物体获得一定的遗传性状11 DNA RNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译逆转录逆转录简单定义：转录简单定义：转录 ＋翻译＋翻译广义：包括广义：包括 rRNA、、tRNA的表达的表达12二、基因表达调控的意义二、基因表达调控的意义 生生物物体体基基因因数数量量很很多多，，但但在在某某一一特特定定时时期期只只有有一一小小部部分分基基因因处处于于活活化化状状态态，，能能进进行行转转录录（（例例如如，，真真核核细细胞胞约约2 2～～5 5％％基基因因具具转转录录活活性性））。

因因此此，，机机体体内内存存在在着着复复杂杂的的调调节节机机制，调节基因的表达制，调节基因的表达通过调控基因的表达，使生物体适应环境、通过调控基因的表达，使生物体适应环境、调节代谢、维持其生长与繁殖调节代谢、维持其生长与繁殖基因表达调控的意义：基因表达调控的意义：13三、基因表达的规律三、基因表达的规律*Ø 阶段特异性阶段特异性 （时间特异性）（时间特异性）Ø 组织特异性组织特异性 （空间特异性）（空间特异性）14Ø 阶段特异性阶段特异性 （时间特异性）（时间特异性）甲胎蛋白甲胎蛋白 某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发 生，称生，称时间特异性时间特异性* 多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定多细胞生物的不同基因在不同发育阶段按特定 时间顺序开启和关闭，称时间顺序开启和关闭，称阶段特异性阶段特异性*哺乳类哺乳类nAChR：： 胚胎型胚胎型α2βγδ(烟碱型乙酰胆碱受体烟碱型乙酰胆碱受体) 成年型成年型α2βεδ15Ø 组织特异性组织特异性 （空间特异性）（空间特异性）在个体生长的某一阶段，在个体生长的某一阶段， 不同细胞有不同不同细胞有不同基因表达基因表达胰岛素：胰岛胰岛素：胰岛 细胞细胞血红蛋白：红细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X YX Y AB16四、基因表达的方式四、基因表达的方式 有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可有些基因的产物对于生物体的整个生命过程都是必不可少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，少的，这类基因在生物体的几乎所有细胞中持续表达，这类基因被称为这类基因被称为管家基因。

管家基因这类基因的表达称为这类基因的表达称为基本的基本的基因表达基因表达* 例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因例如：葡萄糖酵解途径中各种酶的编码基因基本的基因表达也是在一定机制控制下进行基本的基因表达也是在一定机制控制下进行（一）基本的基因表达（一）基本的基因表达17（二）可调节的基因表达（二）可调节的基因表达 与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外与管家基因不同，另一些基因表达状况极易受外环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平环境变化的影响，随外环境变化，这类基因表达水平可升高或降低可升高或降低,又称又称适应性表达适应性表达；又称；又称奢侈基因奢侈基因 特点：不是细胞生命必不可少的特点：不是细胞生命必不可少的 表达受外环境的影响较大，不恒定表达表达受外环境的影响较大，不恒定表达 有间断性和空间特异性有间断性和空间特异性 18 诱导诱导 基因表达水平在特定环境中增高的现象基因表达水平在特定环境中增高的现象 这类基因叫这类基因叫可诱导基因可诱导基因阻遏阻遏基因对环境信号应答表现为表达水平降低基因对环境信号应答表现为表达水平降低这类基因叫这类基因叫可阻遏基因可阻遏基因 DNA损伤：损伤：DNA损伤修复酶被诱导损伤修复酶被诱导 色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏色氨酸供应充足：参与合成色氨酸的酶被阻遏19五五.基因表达的多级调控基因表达的多级调控基因表达调控在多级水平上进行基因表达调控在多级水平上进行基因激活基因激活 转录起始转录起始* 转录后加工及转运转录后加工及转运 mRNA降解降解 翻译及翻译后加工翻译及翻译后加工 蛋白质降解蛋白质降解20六、基因表达调控原理六、基因表达调控原理以以mRNA转录为例转录为例DNA元件元件 调节蛋白调节蛋白RNA聚合酶活性聚合酶活性*调控要素调控要素（一）转录起始调节基因表达（一）转录起始调节基因表达21 （（1）） DNA元件：元件：具有调节功能的特异具有调节功能的特异DNA序列序列操纵子：操纵子：由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染由功能上相关的一组酶或蛋白质基因在染色体上串联一起并共同享用同一表达调控的色体上串联一起并共同享用同一表达调控的DNA组组件所构成的一个转录单位。

件所构成的一个转录单位操纵子操纵子调节序列调节序列编码序列：编码蛋白质编码序列：编码蛋白质启动序列：结合启动序列：结合RNA聚合酶聚合酶操纵序列：结合阻遏蛋白操纵序列：结合阻遏蛋白*1、原核生物、原核生物22 操纵子操纵子结构结构编码序列编码序列 启动序列启动序列 操纵序列操纵序列其他调节序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)23 原核生物启动序列（启动子）原核生物启动序列（启动子）RNA转录起始转录起始-35区区-10区区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列一致序列24 （（2））调节蛋白调节蛋白特异因子特异因子 决定决定RNA聚合酶特异识别并结合聚合酶特异识别并结合 启动序列的能力启动序列的能力（（σ因子）因子）阻遏蛋白阻遏蛋白 与操纵序列结合，抑制与操纵序列结合，抑制RNA聚合酶活性聚合酶活性 （负性调节）（负性调节）激活蛋白激活蛋白 促进促进RNA聚合酶活性聚合酶活性（正性调节）（正性调节）25 （（3）） RNA聚合酶活性聚合酶活性 DNA元件元件与与调节蛋白调节蛋白对转录激活的调对转录激活的调节作用最终由节作用最终由RNA聚合酶活性聚合酶活性体现。

体现 启动序列或启动子的结构、调节蛋白启动序列或启动子的结构、调节蛋白的性质对的性质对RNA聚合酶活性影响最大聚合酶活性影响最大 262. 真核生物真核生物（（1）） 顺式作用元件：顺式作用元件：（（2）） 反式作用因子：反式作用因子： （（3）） mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节27第二节第二节 原核基因表达调控与原核基因表达调控与真核基因表达调控的基本原理真核基因表达调控的基本原理28一、原核基因表达及其调控的特点一、原核基因表达及其调控的特点 1、转录与翻译两过程紧密偶联、转录与翻译两过程紧密偶联 3、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导、操纵子调节机制中普遍存在阻遏蛋白介导 的负性调节的负性调节*2、普遍存在操纵子调节机制、普遍存在操纵子调节机制阻遏蛋白阻遏蛋白操纵序列操纵序列结合结合阻遏阻遏解聚解聚结合结合去阻遏去阻遏 阻碍阻碍29 4、转录产物为多顺反子、转录产物为多顺反子mRNA 5、、转录起始转录起始是基因表达调控的最关键环节是基因表达调控的最关键环节*多顺反子多顺反子mRNA：：多个功能相关的基因串联，多个功能相关的基因串联， 转录产物在转录产物在 一条一条mRNA上，翻译产物为多个多肽链上，翻译产物为多个多肽链30二、操纵子理论二、操纵子理论通常一个操纵子含有通常一个操纵子含有一个启动序列及数个编码基因一个启动序列及数个编码基因（（2～～6个，甚至更多），还有其它调节序列。

个，甚至更多），还有其它调节序列 编码序列编码序列 启动序列启动序列 操纵序列操纵序列其他调节序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操纵子操纵子结构结构31乳糖操纵子乳糖操纵子调节机制调节机制 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节 CAP的正性调节的正性调节 协调调节协调调节32 乳糖操纵子结构乳糖操纵子结构 CAP结合位点结合位点P IIPOZYA调控区调控区结构基因结构基因I: 阻遏蛋白编码基因阻遏蛋白编码基因　　PI: 阻遏蛋白基因启动序列阻遏蛋白基因启动序列　　Z: β-半乳糖苷酶　半乳糖苷酶　Y: 透酶透酶　　A: 乙酰基转移酶乙酰基转移酶结构基因结构基因O:操纵序列操纵序列（阻遏蛋白结合部位）　（阻遏蛋白结合部位）　P:启动序列启动序列CAP结合位点结合位点调控区调控区33 1. 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节（无乳糖）（无乳糖） *阻遏蛋白与阻遏蛋白与O序列结合序列结合, 抑制转录抑制转录, lac操纵子操纵子关闭关闭阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP结合位点结合位点P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 34 诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与诱导剂结合于阻遏蛋白，阻遏蛋白与O序列序列解离，转录抑制解除，解离，转录抑制解除，lac操纵子开启操纵子开启乳糖乳糖别乳糖别乳糖CAP结合位点结合位点P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节（（有乳糖有乳糖）） * 35 CAP: 分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚体同二聚体cAMP 结合区结合区 DNA 结合区结合区36 2. CAP的正性调节的正性调节（（无葡萄糖无葡萄糖）） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP结合位点结合位点mRNA无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高浓度高cAMP与与CAP结合结合 与与CAP结合位点结合结合位点结合转录活性提高约转录活性提高约50倍倍 37 CAP的正性调节的正性调节（（有葡萄糖有葡萄糖）） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP结合位点结合位点mRNA有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低浓度低cAMP与与CAP结合受阻结合受阻转录活性下降转录活性下降 38 阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP结合位点结合位点P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 3. 阻遏蛋白与阻遏蛋白与CAP的协调调节的协调调节*（（1）无乳糖时）无乳糖时, 阻遏蛋白封闭转录，阻遏蛋白封闭转录， CAP无作用无作用39 （（2）） 有乳糖时有乳糖时, 乳糖操纵子去阻遏乳糖操纵子去阻遏, 虽可转虽可转 录录, 但活性很低但活性很低, 必须由必须由CAP的正性调节来加强的正性调节来加强P IIPOZYACAP结合位点结合位点mRNA 40 乳糖操纵子乳糖操纵子强强的转录活性的转录活性既需要乳糖存在既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖又需要缺乏葡萄糖41（一）真核基因结构特点（一）真核基因结构特点 1. 转录产物为单顺反子转录产物为单顺反子 一个基因一个基因—— 一条一条mRNA—— 一条多肽链一条多肽链2. 重复序列重复序列 高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列3. 基因不连续性基因不连续性 非编码序列非编码序列 内含子内含子1235’3’三、真核基因表达调控三、真核基因表达调控42 （二）（二） 真核基因转录特点真核基因转录特点1.活性染色体结构变化活性染色体结构变化2. 对核酸酶敏感、甲基化程度降低、对核酸酶敏感、甲基化程度降低、 组蛋白乙酰化修组蛋白乙酰化修饰饰2. 正性调节占主导正性调节占主导 真核真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有 实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用实质的亲和力，转录起始需依赖多种激活蛋白的作用3．转录与翻译分隔进行．转录与翻译分隔进行 转录在核内进行，翻译在胞浆进行转录在核内进行，翻译在胞浆进行43 转录（起始）调节实质上是调节蛋白与转录（起始）调节实质上是调节蛋白与DNA的相互作用的相互作用 1、、顺式作用元件：顺式作用元件：2、、反式作用因子：反式作用因子： 3、、mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节（三）真核基因转录激活调节（三）真核基因转录激活调节44 1. 顺式作用元件顺式作用元件* 指指结结构构基基因因两两侧侧或或内内部部具具有有调调节节功功能能的的DNA序序列列，，因因其其作作用用于于自自身身分分子子并并发发挥挥作作用用，，所以称所以称顺式作用元件。

顺式作用元件 根根据据位位置置、、性性质质及及作作用用方方式式的的不不同同分分为为启启动子、增强子和抑制子动子、增强子和抑制子45 真核生物真核生物—— 顺式作用元件顺式作用元件结构基因序列结构基因序列 启动子启动子(promoter)P 抑制子抑制子(silencer) 增强子增强子(enhancer) 增强子增强子(enhancer)46RNA聚合酶聚合酶II启动位点周围一启动位点周围一 组转录控制组件组转录控制组件常见组件：常见组件： TATA盒盒（（TATAAA）） -25bp ~ -30bp GC盒盒 （（GGGCGG）） CAAT盒盒（（CCAATC））CAAT盒盒GC盒盒TATA盒盒转录起始点转录起始点-30bp ~ -110bp启动子启动子 promoter47 Ø 增强子增强子* ：： 远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转远离转录起始点、决定组织特异性表达、增强启动子转 录活性的特异录活性的特异DNA序列，其发挥作用的方式与方向、距序列，其发挥作用的方式与方向、距 离无关Ø 抑制子抑制子* ：： 对启动子转录活性起抑制作用的对启动子转录活性起抑制作用的 DNA序列序列 负性调节元件负性调节元件48 2、反式作用因子（转录因子）、反式作用因子（转录因子） 转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白转录因子、转录调节因子、转录调节蛋白u 基本转录因子基本转录因子u 转录激活因子转录激活因子u 转录抑制因子转录抑制因子 49 绝大多数转录因子属于绝大多数转录因子属于反式作用因子反式作用因子*真核生物：真核生物：由某一基因表达后，通过由某一基因表达后，通过DNA-蛋白质或蛋白质蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用控制另一基因的转录。

蛋白质相互作用控制另一基因的转录50 AB51 RNA聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子聚合酶结合启动子所必须的一组转录因子u 基本转录因子基本转录因子FEBDARNA pol ⅡⅡ TATADNATATA TFⅡⅡD TFⅡⅡA TFⅡⅡB TFⅡⅡF TFⅡⅡERNA polⅡⅡ52 u 转录激活因子转录激活因子 （正性调节因子）（正性调节因子） 通过通过DNA－－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起 正性调节作用的转录因子正性调节作用的转录因子u 转录抑制因子转录抑制因子 （负性调节因子）（负性调节因子） 通过通过DNA－－蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起负蛋白质、蛋白质－蛋白质相互作用起负 性调节作用的转录因子性调节作用的转录因子与增强子结合的转录因子与增强子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子与抑制子结合的转录因子53真真核核RNA聚聚合合酶酶II不不能能单单独独识识别别启启动动子子，，而而是是由由基基本本转转录录因因子子TFIID识识别别并并结结合合启启动动子子，，形形成成TFIID－－启启动动子子复复合合物物，，然然后后有有一一系系列列的的转转录录因因子子（（如如TFIIA、、TFIIB、、TFIIE、、TFIIF等等））加加入入形形成成前前起起始始复复合合物物，，调节转录的起始。

调节转录的起始3．．mRNA转录激活及其调节转录激活及其调节54第三节第三节 重组重组DNA技术技术55基因重组（基因重组（genetic recombination））Ø 自然发生的基因重排自然发生的基因重排Ø 真核、原核均会发生真核、原核均会发生Ø 基因变异、物种演变、生物进化的基础基因变异、物种演变、生物进化的基础基因工程（基因工程（genetic engineering）重组）重组DNA技术技术人工进行基因重组人工进行基因重组56 克隆克隆*(名词名词)：：就是指来自同一母本的所有副本就是指来自同一母本的所有副本或或 拷贝的集合拷贝的集合 克隆化（动词）：克隆化（动词）：获取同一拷贝的过程获取同一拷贝的过程二、重组二、重组DNA技术相关概念技术相关概念母本母本克隆克隆clonecloning（一）（一） 克隆与克隆化克隆与克隆化57 细胞克隆：细胞克隆： 从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞，从大量群体细胞中分离出某一种类型细胞， 经扩增获得这样一类相同的细胞。

经扩增获得这样一类相同的细胞在分子生物学领域所说的分子克隆专指在分子生物学领域所说的分子克隆专指 DNA克隆克隆(DNA cloning) 分子克隆：分子克隆： 从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合从众多不同的分子群体中分离到的很多相同分子的集合58（二）（二）重组重组DNA技术技术* 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（目的基因或目的（目的基因或目的DNA）与载体）与载体DNA连接成复制子，连接成复制子，然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、然后通过转化或转染等方法导入宿主细胞，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞转化子细胞经筛选出含有目的基因的转化子细胞转化子细胞经扩增、提取，获得大量目的扩增、提取，获得大量目的DNA的无性繁殖系，即的无性繁殖系，即DNA克隆，基因工程克隆，基因工程 59 目的目的 DNA 载体载体DNA连接连接复制子（重组复制子（重组DNA））导入宿主细胞导入宿主细胞 （转化或转染）（转化或转染）转化子细胞转化子细胞转化子细胞扩增，可获得大量重组转化子细胞扩增，可获得大量重组DNA 60 基因克隆基因克隆DNA 克隆克隆重组重组DNA同一概念同一概念生物技术工程生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程• 获得获得DNA的无性繁殖系的无性繁殖系• 获得目的基因的表达产物获得目的基因的表达产物重组重组DNA的目的的目的 61（三）（三） 工具酶工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶62 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶*识别和切割双链识别和切割双链DNA分子内部特异核苷酸序列分子内部特异核苷酸序列的一类核酸酶。

的一类核酸酶限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用限制性核酸内切酶共分三类，基因工程常用II类酶，这类酶常识别类酶，这类酶常识别DNA的回文序列的回文序列 * 63 Hpa I：：5’- GTT AAC - 3’ 3’- CAA TTG -5’平端平端Pst I：： 5’- CTGCA G - 3’ 3’- G ACGTC -5’3’突出粘性末端突出粘性末端EcoRI：：5’- G AATT C - 3’ 3’- C TTAA G -5’5’突出粘性末端突出粘性末端64 （四）目的基因（四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在体外以在体外以RNA（通常为（通常为mRNA）为模板，）为模板，经反转录合成的单链经反转录合成的单链DNA基因组基因组DNA(genomic DNA) 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有所有DNA序列目的基因又称外源目的基因又称外源DNA65 携带外源携带外源DNA，实现外源，实现外源DNA无性繁殖或表达有意义的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些蛋白质所采用的一些DNA分子。

分子 常用载体：常用载体： 质粒质粒 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA质粒质粒 （（1）双链环状）双链环状DNA，细菌染色体外，细菌染色体外 （（2））2 - 3kb 或或 数百数百kb （（3）独立自主复制，稳定遗传）独立自主复制，稳定遗传 （（4）遗传标志）遗传标志 (五五) 基因载体基因载体 （克隆载体）（克隆载体）66三、重组三、重组DNA技术技术的原理的原理 与基本过程与基本过程*1. 获取目的基因获取目的基因2. 选择、构建基因载体选择、构建基因载体3. 目的基因与载体连接，形成重组分子目的基因与载体连接，形成重组分子4. 重组分子导入受体细胞重组分子导入受体细胞5. 筛选、扩增筛选、扩增6. 表达目的基因表达目的基因67 +载体载体目的基因目的基因重组重组DNA分子分子细菌细菌转化或转染转化或转染扩增扩增筛选筛选68（（1）） 化学合成化学合成 （（4）） PCR（（2）） 基因组基因组DNA文库文库 （（3）） cDNA文库文库 1. 获取目的基因获取目的基因69 组织或细胞染色体组织或细胞染色体 限制性内切酶限制性内切酶多个多个DNA片段片段载体载体多种转化子多种转化子 （基因文库）（基因文库）重组重组DNA 导入宿主细胞导入宿主细胞mRNA逆转录逆转录cDNAcDNA文库文库70聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）） 在有特定模板、特异在有特定模板、特异DNA引物及合成引物及合成DNA所需要的所需要的dNTP存在时，向存在时，向DNA合成体系内加入耐热的合成体系内加入耐热的DNA聚合聚合酶（酶（如如Taq DNA聚合酶聚合酶* ），经反复变性、退火及延），经反复变性、退火及延伸的多个循环反应，生成特异伸的多个循环反应，生成特异DNA产物的过程。

产物的过程 71 变性：变性：解开模板双链解开模板双链DNA 95 ℃退火：退火：使引物与单链模板使引物与单链模板DNA结合结合 55 ℃延伸：延伸：DNA链的合成链的合成 72 ℃72 2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建 目的基因不能自我复制目的基因不能自我复制 3. 目的基因与载体连接（目的基因与载体连接（DNA连接酶连接酶* ））重组重组DNA4. 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌安全菌安全菌 感受态感受态导入方式：转化导入方式：转化 转染转染 感染感染73 5. 重组体的筛选重组体的筛选（（1）直接选择法）直接选择法 抗药性标志选择抗药性标志选择 ampr tetr kanr 标志补救标志补救 α互补互补 分子杂交分子杂交（（2）非直接选择法）非直接选择法 常用免疫学方法常用免疫学方法 特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高74 6. 克隆基因的表达克隆基因的表达 常见表达体系：常见表达体系：（（1）原核）原核——大肠杆菌（简单、迅速、经济）大肠杆菌（简单、迅速、经济） 缺点：无转录后加工缺点：无转录后加工——适于表达适于表达cDNA 无翻译后加工无翻译后加工——无糖基化修饰无糖基化修饰 包涵体包涵体 （（2）真核）真核——酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞表达有生物活性的蛋白质表达有生物活性的蛋白质75四、四、重组重组DNADNA技术技术的应用的应用1. 疾病基因的发现疾病基因的发现镰刀形红细胞贫血镰刀形红细胞贫血脆性脆性X X综合征综合征( (FMRIFMRI基因沉默基因沉默) ) 2. 生物制药生物制药 利用利用基因工程基因工程技术生产有技术生产有药用价值药用价值的蛋白质、多肽的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项产品已成为当今世界上的一项重大产业重大产业。

如生产干扰素、如生产干扰素、胰岛素、细胞因子等胰岛素、细胞因子等 763. DNA诊断诊断 DNA诊断诊断又称又称基因诊断基因诊断，，是利用分子生物学及分子遗是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在传学的技术和原理，在DNA水平上水平上分析、鉴定分析、鉴定遗传性疾病遗传性疾病所涉及的基因置换、缺失或插入等突变所涉及的基因置换、缺失或插入等突变 4. 基因治疗基因治疗 所谓所谓基因治疗基因治疗就是向功能缺陷的细胞就是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基补充相应功能的基因因，，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的对于以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的对于基因治疗，人们担心的潜在基因治疗，人们担心的潜在危险之一危险之一是可能会引起未知的遗是可能会引起未知的遗传效应，如肿瘤等，此外还涉及社会伦理方面的争论传效应，如肿瘤等，此外还涉及社会伦理方面的争论 5. 遗传病的预防遗传病的预防77 本章重点本章重点Ø 基本概念基本概念 基因表达、操纵子、基因表达、操纵子、DNA元件、顺式作用元件、元件、顺式作用元件、 反式作用因子（转录因子）、启动子、增强子、反式作用因子（转录因子）、启动子、增强子、 基因工程、限制性核酸内切酶、管家基因基因工程、限制性核酸内切酶、管家基因Ø 原核基因表达调控特点原核基因表达调控特点 Ø 乳糖操纵子结构及作用机制乳糖操纵子结构及作用机制 Ø 基因表达调控的规律、方式、要素基因表达调控的规律、方式、要素 78 Ø PCR原理及基本过程原理及基本过程 Ø 重组重组DNADNA技术技术基本原理基本原理 Ø 真核基因转录特点真核基因转录特点 Ø 真核基因转录激活调节真核基因转录激活调节 Ø 真核基因结构特点真核基因结构特点 79。