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植物组织培养技术实验指导 T植物细胞组织造就技术试验指导书 中国计量学院生命科学学院二零零六年七月 《植物细胞组织造就》试验指导 目 录 试验一、植物组织造就造就基母液的配制 试验二、植物组织造就的造就基配制 试验三、康乃馨的离体快繁 试验四、胡萝卜愈伤组织的建立 试验五、组织造就物的继代造就 1 试验一 组织造就基母液的配制 一、 仪器及药品 冰箱、天平〔0.0001g〕 容量瓶: 1010 ml, 500 ml、250 ml、101 ml、25 ml 广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml 烧杯：1010 ml 、500 ml 、250 ml、101 ml 、50 ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH 几种常用的造就基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 遵照造就基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6造就基各种母液的配制步骤如下：大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6造就基配方〉，按表中排列依次,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后遵照依次混合在一起。

如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最终加上蒸馏水，定容至1升或500毫升在定容时留意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以削减误差定容后的溶液为大量元素母液，配制造就基时，每配1 L造就基需吸取该母液l00 ml或50 ml微量元素母液：因用量少，为了称量准确和便利,常配成 101倍或1010倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6造就基需吸取该母液10 ml或者1 ml铁盐：在N6造就基中须要单独配制，它是由硫酸亚铁〔FeSO4?7H2O〕2.78 g和乙二氨四乙酸二钠〔Na2-EDTA〕3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L冰箱过夜贮藏无结晶析出，否那么重新配制每配l升N6造就基需加该铁盐母液5 ml 2 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质它们大都是扩大1010倍，分别称量，分别定容和储存，配制造就基时按须要的量参加植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、 萘乙酸〔NAA〕、吲哚乙酸〔IAA〕、吲哚丁酸〔IBA〕；细胞分裂素类：激烈素〔KT〕、6-苄基氨基嘌呤〔6-BA〕、玉米素〔ZT〕。

配制时须要单个称量，依据须要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后 ,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含 0.1-2 mg，配制造就基时按所须要的量分别参加，本试验中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液在配制吲哚乙酸〔IAA〕母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否那么会发生沉淀而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解 表1 N6 朱至清(1975)造就基配方 大量元素 配方量(mg/L) 463 2 830 166 185 400 铁盐 37.3 27.8 微量元素 4.0 3.8 1.6 0.8 有机物质 0.5 0.5 1 1010× 0.5 0.5 1010× 101× 母液倍数 10× 称取量(g/L) 4.63 28.3 1.66 1.85 4.0 3.73 2.78 4.0 3.8 1.6 0.8 1.0 药品名 (NH4)2SO4 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4 Na2- EDTA FeSO4·7H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI 盐酸硫胺素(VB1) 烟酸 盐酸吡哆醇(VB6) 甘氨酸 2.0 32.0 各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L造就基须要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。

一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但假设发觉有沉淀或霉变,应马上需重新配制三、留意事项1. 如药品所带结晶水不同，应进展换算2. 因常用的MS造就基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本试验采纳N6造就基替代MS造就基 4 试验二 造就基的配制 一、仪器设备及试剂电炉天平〔0.0001 g〕 高压灭菌锅量筒：l0 ml、20 ml、101 ml、500 ml 烧杯：1010 ml、500 ml、250 ml 移液管：1 ml、2 ml、 5 ml 吸管假设干、记号笔 三角瓶或试管、试管架 锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调整剂等，个别生长调整剂要随配随用 蒸馏水、pH试纸 蔗糖、琼脂 等1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液 二、方法和步骤 1 量取所配造就基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升造就基, 先量取约700 ml体积的水2 依据造就基配方， 用量筒量取所须要的各种元素的母液参加体积或重量101ml 1 ml 1 ml 10 ml 30 g 8 g物质大量元素母液(10×) 微量元素母液(1010×) 有机物质母液(1010×) 铁盐母液(1010×) 蔗糖 琼脂 5 吸取母液时，留意应先将几种母液按依次排好，不要弄错以免使造就基中药品成分发生变更。

在造就不同的外植体时，应参加不同的激素，如本试验中造就康乃馨侧芽或茎段时就参加1ml的1 mg/ml的6-BA；而另一个试验胡萝卜愈伤组织造就中应参加2ml的1 mg/ml的2,4-D参加一种母液后应先搅拌匀称，幸免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于参加蔗糖调整完pH值后再参加，此时应留意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可留意烧杯内溶液是否透亮3 调整造就基的pH值，用pH计或pH试纸测定造就基的pH遵照造就材料的要求分别用 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液来调整所配制造就基的pH值，一般造就基的pH值约为5.8，造就的材料不同，对造就基的pH值要求也不同4 分装 将配制好的造就基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的造就皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进展高压灭菌5 造就基的灭菌 一般用手提式医用高压锅来灭菌〔方法略〕，本试验采用全自动高压灭菌锅6 造就基的保存 消毒过的造就基通常放在接种室或造就室中保存，一般 应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月三、留意事项激素应在调整pH之前参加，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调整pH好之后参加会变更pH值。

pH过酸或过碱对造就基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响造就质量在本次试验中将下次试验所需的其它材料一同灭菌处理 6 试验三 康乃馨的离体快繁一、 仪器设备和试剂超净工作台、带有吸水纸的成套的造就皿，无菌水 造就基 N6+1 mg/L 6-BA 剪刀、枪型镊子量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔 纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等二、试验材料 康乃馨枝条 三、方法和步骤1 外植体灭菌 取从市场上购置的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂〔洗洁精〕清洗外表，再用自来水冲洗 30-60分钟，然后在无菌室〔超净工作台〕内用70%酒精浸没20-40秒钟〔依据材料的木质化程度驾驭详细的浸没时间用0.2% 的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的造就皿中的滤纸上待用2 接种 先进展无菌室内消毒，用紫外灯照耀30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟前方可进去工作。

超净工作台消毒 开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟前方可工作并用70% 的酒精棉球擦净工作台接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，快速翻开三角瓶口，将材料才插入瓶内，留意材料上下端的极性，不能倒插在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料3 造就条件： 25℃光照13小时/天 光强1010 Lux 4 继代造就〔见下一个试验〕5 诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6造就基诱导生根 6 试管苗移栽〈参见有关其它试验〉7试验四 胡萝卜愈伤组织的建立 一、 材料和设备超净工作台或者无菌接种室 造就基 N6+2 mg/L 2,4-D带有吸水纸的成套的造就皿，无菌水 解剖刀、枪型镊子、刀片 无病虫的胡萝卜直根数十个 消毒剂 0.2%的升汞溶液70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球l000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子〔可用一次性牙刷〕二、试验材料 别致胡萝卜、胡萝卜愈伤组织 三、试验步骤'1 选择无伤、无病、形态较规那么的胡萝卜，用小刷子在流淌的自来水下洗刷胡萝卜，除净外表全部的泥屑。

可以依据试验的时期，选用其它的试验材料2 将胡萝卜切成大约 40 mm厚的片段,放入101或500 ml的烧杯中，倒入消毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30 min在灭菌过程中，在每个材料上做好标记，并对应地放在预接种的造就基边上接种后在造就瓶上标明造就物名称和造就日期 3 在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5次，以便去除残留的消 毒液4 取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的造就皿中，用无菌解剖刀从两端各切去10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片取其中的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的造就皿中，再将每一片切成小块，使其每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量相同5 接种 取下造就瓶的塞子〔或锡铂纸〕，用火灼烧瓶口2 cm处，手持造就瓶呈45o角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂造就基的外表，留意把靠近根尖的一面接触造就基然后马上将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口每两次转移 8之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌 6 造就 接种好的外植体在25℃的造就箱中，黑暗条件下造就四周左右就会形成一块较大的愈伤组织 9 试验五 组织造就物的继代造就 一、 材料和设备材料 从造就4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体 超净工作台造就基 N6+0.5 mg/L 2,4-D N6+2 mg/L 6-BA〔也可以自已设计〕 三角瓶、带有吸水纸的成套的造就皿、镊子、解剖刀 70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球 酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶 二、方法步骤1 取材 在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶造就物，灼烧造就瓶口约20 毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的造就皿中。

每个造就皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织把每块愈伤组织分成两、三个不小于5 mm见方的小块外植体下面对着中心的细胞常呈坏死状,不相宜作继代造就这些坏死的局部应当与正常的局。