smallRNA的世界.ppt

第四章第四章RNA世界世界儒业攘浆峦吟沿经累煎虱劣懈辆嘘贫佩茬笨绚奋蔚徊婿雨蓖回淹焕烂寓坚smallRNA的世界smallRNA的世界对对RNA的传统认识的传统认识•RNA是真正重要的核苷酸是真正重要的核苷酸DNA的一种一次性使用的一种一次性使用的拷贝DNA是我们基因和染色体的原料，决定是我们基因和染色体的原料，决定着我们的遗传特征，而着我们的遗传特征，而RNA只是只是DNA指令的一个指令的一个拷贝，是指导蛋白质合成的信使，在旅行职责后拷贝，是指导蛋白质合成的信使，在旅行职责后被催化分解被催化分解 暂揩刨穿霞扭镜观劣坤通争载骡蕴蛋建嫁镶考塌恕彪揣酬彰裙疹趟根登独smallRNA的世界smallRNA的世界The Nobel Prize in Chemistry 1989Sidney AltmanThomas R. Cech1/2 of the prize1/2 of the prizeCanada and USAUSAYale University New Haven, CT, USAUniversity of Colorado Boulder, CO, USAb. 1939b. 1947"for their discovery of catalytic properties of RNA"赌袒载焰董眷励营门犬盆僻段樟蒙岛侠堰愁缎殖竿原狸篇络孝衅熊瞪晌哄smallRNA的世界smallRNA的世界RNA World hypothesis Ø1986，诺贝尔化学奖（，诺贝尔化学奖（ 1981）获得者）获得者   W. Gilbert提出提出“RNA世界世界”假说：假说： “生命起源生命起源   之某时期，生命体仅由一种高分子化合物之某时期，生命体仅由一种高分子化合物RNA组组成。

遗传信息传递建立于成遗传信息传递建立于RNA的复制，复制机理的复制，复制机理与当今与当今DNA复制机理相似，作为生物催化剂的、复制机理相似，作为生物催化剂的、由基因编码的蛋白质还不存在由基因编码的蛋白质还不存在”"The RNA World", Nature 319: 618 专哀车拜供防譬盯帛吓峙麻氖姨隋彝瘴庙戳汤稠陪盐义芦鞠蓑呜确泡驹障smallRNA的世界smallRNA的世界DNA拷拷贝出出单链RNA，然后，然后RNA被折叠成复被折叠成复杂的形状的形状 逛咖锹鱼滤划诣榨乾柏久惜条阁笑衷遥芦酬但高狈勤恬夹哺怕凋湛锯盯云smallRNA的世界smallRNA的世界RNA的特性的特性Ø 2’羟基羟基——化学性质较化学性质较DNA活跃，易突变，携带活跃，易突变，携带遗传信息能力不如遗传信息能力不如DNA；组成没有蛋白质复杂；组成没有蛋白质复杂——不如蛋白质结构多样，功能分子作用不如蛋白不如蛋白质结构多样，功能分子作用不如蛋白质；唯一既能携带遗传信息又可为功能分子的生质；唯一既能携带遗传信息又可为功能分子的生物高分子化合物物高分子化合物Ø   “RNA世界世界” 假说假说—— RNA是生命初期最关键是生命初期最关键的分子，后来当的分子，后来当DNA和蛋白质的功能远远超过最和蛋白质的功能远远超过最初初RNA的作用时，它才退到了次要地位。

的作用时，它才退到了次要地位  苗伙活猪尊锯接锚妨平颁孜于疯潦殖屋物紧莆欧狠兹排迅撵临块丸锗沙吭smallRNA的世界smallRNA的世界瞻蔗线渭烯舞铝乃畴毡辕委糊持蒸崖忆填灭劝枚奥眼计瓜锐捍呻狸岭浅仅smallRNA的世界smallRNA的世界一、核一、核酶酶（（Ribozyme）的）的发现Ø1982年，年， Cech等研究四膜虫等研究四膜虫rRNA时，，发现RNA具有催化功能区具有催化功能区别于于传统蛋白蛋白酶酶，，Cech给这种种具有催化活性的具有催化活性的RNA 定名定名为核核酶酶Ø1983年年Altman 等人在研究等人在研究细菌菌RNase P时，，发现tRNA分子前体的多余序列由分子前体的多余序列由RNA切除切除 骨枣赦侄烽酸灯架梳剿箕侈橱冷理羌荧词套卧拍饰您剩码歹阴雀脊叔环忻smallRNA的世界smallRNA的世界1. 新生新生RNA的剪接和修饰的剪接和修饰 ØmRNAØtRNAØrRNA菲校惑元贞增价淡号痕肃笼抿堤裕杭平猾帝拓樱专奏这匆脉妆恃组徘问孵smallRNA的世界smallRNA的世界 mRNA的剪接（的剪接（mRNA splicing ））hnRNA /pre-mRNA核内的初级核内的初级mRNA称为杂化核称为杂化核RNA (hetero-nuclear  RNA, hnRNA)，或，或mRNA前体（前体（ pre-mRNA））袍舰剑踪蛇袜塘伴帐脚屏寄砷道忱咽穴坡亏惊棚嚎窿熊虚镁搓讲贱空虞沤smallRNA的世界smallRNA的世界编码区编码区 A、、B、、CABC非编码区非编码区断裂基因断裂基因(splite gene)        真核生物结构基因，由若干个编码区真核生物结构基因，由若干个编码区（（coding region）和非编码区（）和非编码区（non-coding region）互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非）互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。

完整蛋白质，这些基因称为断裂基因鸭衍限竣卜义楚哲中啪乙溅兔鄙澎隔畸茂恫旬刻柜遮淳版悄捶陆珠尤塞煤smallRNA的世界smallRNA的世界内含子的分类内含子的分类        根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为分为4类：类： • I：：主要存在于核、线粒体、叶绿体编码的主要存在于核、线粒体、叶绿体编码的rRNA、、         mRNA、、tRNA基因；基因；• II：：真菌、藻类、植物之线粒体和叶绿体真菌、藻类、植物之线粒体和叶绿体mRNA；； •III：：是常见的形成套索结构后剪接（剪接体），是常见的形成套索结构后剪接（剪接体），          大多数大多数mRNA基因有此类内含子；基因有此类内含子； • IV：：是是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，基因及其初级转录产物中的内含子，            剪接过程需内切酶及剪接过程需内切酶及ATP丙连年玛逝张煌船烘离革膝牟非蝗派作腰洱蟹豁啼鸡拔砷凋漆渤菲染铅酶smallRNA的世界smallRNA的世界严谰僧只园呐处褪躲我亨医咱虚拘识教禹摄严序张多倡拾刁畸装色溃讲匀smallRNA的世界smallRNA的世界tRNA前体前体RNA pol ⅢⅢDNAtRNA的转录后加工的转录后加工募厕辐纤雍糖掏刀裴闯娟彰勉酚豁帝忠芋壬斟踞注褐怜妆眠炽叉锯段凸锭smallRNA的世界smallRNA的世界SplicingRNase P RNase D内切酶内切酶+连接酶连接酶穿鲁歉全文堰削戴海偏轿欧庐砒核撰砒影锤棋悄糟忧质欠逛苔洼糯退袜呀smallRNA的世界smallRNA的世界裤叼苞玄妙批秋睛珐饯腹劳饭撒弄磅刨急邯儡炼贵烹层疫很届抄晦疏紧履smallRNA的世界smallRNA的世界rRNA的转录后加工的转录后加工（细菌）（细菌）雄傈疟烯输渠坝制扶柴衙奇谋于赁辉悟蝉咯粪颖众俯磋坦粕掩潘侧铝急散smallRNA的世界smallRNA的世界（真核细胞）（真核细胞）昆汞氓蔼湍综窥湃搏员瞅坍劫雁娠俱批腐寅晦雇烫审勃单怀禾赵姜洋妇悯smallRNA的世界smallRNA的世界2.Cech小小组的工作的工作Ø四膜虫四膜虫细胞中胞中DNA转录成成rRNA后，后，rRNA中一些中一些无意无意义的序列，或的序列，或“内含子内含子”（（intron），如何从），如何从RNA分子中剪切下来。

分子中剪切下来Ø四膜虫：原生四膜虫：原生动物，含一种物，含一种RNA，其，其组成中除了成中除了核糖体核糖体RNA外外还有一个由有一个由414个核苷酸个核苷酸组成的插入成的插入序列（序列（intervening sequenc，，IVS））Ø发现：：转录产物物rRNA前体不前体不稳定，在定，在鸟苷和苷和Mg2+存在下切除自身的存在下切除自身的413个核苷酸的内含子个核苷酸的内含子（（IVS），使两个外），使两个外显子拼接起来，子拼接起来，变成成熟的成成熟的rRNA分子无蛋白分子无蛋白质酶酶参加参加——自我剪接自我剪接昂凳文偏懈遮斗氖喷谱票搂稗需登瞒阻旅乌界冒尽目精悄教王筋笑联琼灼smallRNA的世界smallRNA的世界Cech的实验结论的实验结论ØIVSIVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键磷酸二脂键 Ø相信相信rRNArRNA前体能靠自己完成剪接过程在一定前体能靠自己完成剪接过程在一定条件下条件下rRNArRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留己切割自己，以后再把保留rRNArRNA部分的末端连部分的末端连接起来。

即它是可以催化自由底物的具有酶活接起来即它是可以催化自由底物的具有酶活性的性的RNARNAØRNARNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应性的另一个重要方面即催化其他分子的反应孝让萎锁宽磁惺赔会剁猖藩萝赔犯愤耳感獭剿饲谗销澳腻恤煞卷蜒原渠彤smallRNA的世界smallRNA的世界3. Altman小小组的工作的工作Ø细菌菌t-RNA分子的剪接分子的剪接过程程 Ø发现：在：在较高高浓度的度的镁离子和适量精氨酸参与下，离子和适量精氨酸参与下，核酸核酸酶酶P（（ribonuclease P，， RNase P ）中的）中的 RNA能能够切割切割tRNA前体的前体的5’端Ø核酸核酸酶酶P的催化作用是由的催化作用是由RNA完成的，而其中的完成的，而其中的蛋白蛋白质在在细胞内胞内仅仅起起稳定构象的作用定构象的作用 缮格工坠戒厕展夹缺匪良傍桥顺炒意述宦桶滴陀砒封幼盖娜屑搪阑厚倦翻smallRNA的世界smallRNA的世界二、核二、核酶酶的作用机制的作用机制 核酶作用的特点：核酶作用的特点：Ø具有催化功能的具有催化功能的RNA分子分子Ø大多通大多通过催化催化转磷酸磷酸酯和磷酸二和磷酸二酯键水解反水解反应参参与与RNA自身剪切、加工；有些具有自身剪切、加工；有些具有RNA 连接接酶酶、、磷酸磷酸酶酶等活性。

等活性 Ø底物可以是不同的分子底物可以是不同的分子, 亦可亦可为同一同一RNA分子中的分子中的某些部位某些部位Ø 催化效率催化效率较蛋白蛋白质酶酶低颐注蛀嗡贬迢惟王莫纵松夷给仗院爹狡差恬确骚凯旗染怕焦闲潦泌啸敖砰smallRNA的世界smallRNA的世界核酶是一种金属依赖酶核酶是一种金属依赖酶    金属离子的作用：金属离子的作用：•特异的特异的结构作用构作用——提供静提供静电屏障，促屏障，促进RNA的的总体折叠，体折叠，维持核持核酶酶三三维结构构稳定定•参与活性部位的化学反参与活性部位的化学反应——二价金属离子（二价金属离子（Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中渡中间复合物的形成复合物的形成崎屏摈忿苗臂辨星桔灾镇叼舟姜闭沽炮旗垢慧夺违马跨星唐葵砚蠕壳签萨smallRNA的世界smallRNA的世界影响核酶活性的因素影响核酶活性的因素•pH值：：pH7.0  -  7.5 核核酶酶活性最高活性最高•二价金属阳离子（二价金属阳离子（Mg 2+  Mn 2+ ））对活性的影响活性的影响•抗生素抗生素对活性的影响：大多数活性的影响：大多数为抑制效抑制效应•变性性剂对活性的影响活性的影响•温度温度对活性的影响活性的影响 ：： 65℃范范围内随温度升高而增内随温度升高而增加，加，37 ℃时均有适宜的活性。

均有适宜的活性•不需要能量和蛋白因子不需要能量和蛋白因子尼成丁锭浇栏椽刊缸卉扬种象费因宝诧年帖请馆钵曝且椒贰宵翅萄始演柑smallRNA的世界smallRNA的世界剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNase P核酶的分类核酶的分类毫豆瀑凉淄砍硝安晦奋耍邯惋泊技仲霖械览宙续凹囚灶耐氨轮细厂逆诺帚smallRNA的世界smallRNA的世界1.锤头（（Hammerhead)结构核构核酶酶烹尾畴晰淌需包鸟苑损魂刁姓盗写肛准坞靛啼甩茫停公七薪奴黎鼠坑噬迪smallRNA的世界smallRNA的世界从类病毒中分离出来的一类较小的核酶从类病毒中分离出来的一类较小的核酶底物部分底物部分•通常为通常为60个核苷酸左右个核苷酸左右•同同一一分分子子上上包包括括有有催催化化部份和底物部份部份和底物部份  •催催化化部部份份和和底底物物部部份份组组成锤头结构成锤头结构 狗箱稿坛凝刀极店剑席况豺誉倒讲埠札涎寡语折显殖略钨杠升蠢扶训人依smallRNA的世界smallRNA的世界•三个双螺旋区三个双螺旋区•13个核苷酸残基保个核苷酸残基保守序列守序列•剪切反剪切反应在右上方在右上方GUX序列的序列的3’端自端自动发生生•催化催化过程需要二价程需要二价金属离子参与。

金属离子参与结构特点结构特点则季稼彭碟歌葱逾抛逆稚渗铀嚼肃剐纤瑟赢弓撑冕狭高碍耍斋鞠鼓硫怀堤smallRNA的世界smallRNA的世界作用机制作用机制单金属离子催化单金属离子催化双金属离子催化双金属离子催化 题总屿信侥首争翟惯荚壮七抄已搪音氦蜘居洗浇酥玛萍刽哨易醚悼晴占漱smallRNA的世界smallRNA的世界作用底物作用底物拈剪爪枫荧膏毗妇普伙谭班扑眨证氦舍编锣及锁丸眷篆垂放帮汉屋加窗惋smallRNA的世界smallRNA的世界锤头结构的主要构的主要类型型R：：酶酶；；S：底物，箭：底物，箭头：剪切位点：剪切位点驯别找阴公惦母艰蚂遭殷膘篱皂娟灿扶圆苇焚阑掉送闲街簿氦贮刀帘去盘smallRNA的世界smallRNA的世界17位（位（ X ）的核苷）的核苷酸残基多数是酸残基多数是C，不，不能是能是G.7位核苷酸残基的置位核苷酸残基的置换不会对酶活性产换不会对酶活性产生很大影响生很大影响两个特殊位点两个特殊位点177操蓉浆捉染蛔彤殆着玛替划怔痹蹋桌歪血冶兜晴贴团埂聪冻畦慰继逝呈茸smallRNA的世界smallRNA的世界人工设计的核酶人工设计的核酶•粗粗线表示合成的核酸分子表示合成的核酸分子•细线表示天然的核酸分子表示天然的核酸分子•X 表示共有序列表示共有序列•箭箭头表示切断点表示切断点鉴靴肌稠构耕崩吭蹋来译淆招掀年淡惮身挪双缆志烹稽搏甩叭脱雕挫膏凰smallRNA的世界smallRNA的世界特点特点•催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。

以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运•免疫源性低，很少引起免疫反应免疫源性低，很少引起免疫反应•通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强效率高，专一性强胆仰特耙骄舷淹镰胳角揣淬揩梳掺隅残吠帜和疮豌煞肃俐侨紧晶脂馁钥率smallRNA的世界smallRNA的世界应用应用•基础研究基础研究•防治动、植物防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆，烟草花叶病毒核酶等负链的突变核酶的克隆，烟草花叶病毒核酶等•基因治疗：肿瘤，乙肝，基因治疗：肿瘤，乙肝，HIV等坤晾畸讹篷贱狡舶例骇纪腊但娘疫脐思毁下克墟游瞧椭擦幅财碟珊凡吕烛smallRNA的世界smallRNA的世界3.发夹（（hairpin ））结构核构核酶酶•存在于三种植物存在于三种植物RNA病毒（烟草病毒（烟草环点病毒，菊点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒）中苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒）中•金属离子在催化反金属离子在催化反应中起中起结构作用，剪切活性构作用，剪切活性比比锤头结构核构核酶酶高。

高家亥刺晶褥怪趋晴盔涎蜜袒独盅冻滋微乏滇仑转焦吨俱耸杏潘酷玄娱灭云smallRNA的世界smallRNA的世界 发夹二级结构模型二级结构二级结构Ø5环和和4螺旋形成螺旋形成两个两个结构域构域Ø剪切反剪切反应发生在生在底物底物识别序列序列GUC的的5‘端端Ø两个内部两个内部环中的中的碱基及在螺旋区碱基及在螺旋区Ⅱ的的G11和底物中的和底物中的G+1都是都是酶酶发挥作作用所必需的用所必需的戌献鸵柔虏拍惶促止彦克湛上涵嗅抄给燎坞职鞋猜寓苛踊卸氨奥型崭晃谊smallRNA的世界smallRNA的世界4. HDV核核酶酶ØHDV可重复感染乙肝病毒（可重复感染乙肝病毒（HBV)感染的感染的RNA病病毒，可加重毒，可加重HBV感染症状，感染症状，导致肝硬化致肝硬化Ø1.7kb组成的缺陷型成的缺陷型负链RNA病毒，呈病毒，呈环状感染细胞后，通胞后，通过滚环机制机制进行的行的RNA指指导的的RNA复复制，由核制，由核酶酶将将长的的转录物剪切成物剪切成单位位长度的度的RNA病毒核心需要乙肝病毒病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的的HBsAg进行包装，行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒才能形成具有感染活性的成熟病毒颗粒。

所以粒所以HDV总是伴随是伴随HBV感染，否感染，否则HDV的感染就是一的感染就是一个自限性的个自限性的过程而不能形成慢性感染程而不能形成慢性感染 称读般驯秽院孔磊出河域搐冤墙唁永杭盒谣及萝樟烘侄怖得估佣滑励匆街smallRNA的世界smallRNA的世界HDV核核酶酶斧斧头结构模式构模式•三个碱基三个碱基对的茎；需要二价阳离子；的茎；需要二价阳离子；产生生5’-OH和和  2’,3’-环磷酸磷酸剪切部位剪切部位剪切部位剪切部位现蔼减违签彻贞喜茨剐蒲傣郡瑰膳谗幻柒万园仟袭很夹椒墟活赘陋袒剩莱smallRNA的世界smallRNA的世界5. 核糖核酸核糖核酸酶酶 P （（RNase P））•组成：组成： 单链单链RNA分子分子, 长度为长度为375个碱基；相对分个碱基；相对分子质量为子质量为20kDa的多肽的多肽(119个氨基酸残基个氨基酸残基)•功能：功能：RNA具有催化切割具有催化切割tRNA的能力的能力, 蛋白质则蛋白质则起间接的作用起间接的作用,可能是维持可能是维持RNA结构的稳定结构的稳定•定位：广泛存在于原核生物和真核生物（核仁、定位：广泛存在于原核生物和真核生物（核仁、叶绿体和线粒体）中。

叶绿体和线粒体）中•也参与核糖体也参与核糖体RNA的加工 悲终辅鹿搂胀忘疏弯颗强赏炯观钝迷俗椽舒还显憾右南柳弃嗓茹畔给翌仇smallRNA的世界smallRNA的世界•大大肠杆菌杆菌RNase P具有两个具有两个组分：一条分：一条RNA链（（M1-RNA）和一个蛋白）和一个蛋白质（（C5蛋白）•胞内两胞内两组分分对于功能的于功能的发挥都是必要的；体外都是必要的；体外M1-RNA可以独自可以独自发挥催化的功能催化的功能•C5蛋白主要是增蛋白主要是增强强底物底物结合的合的亲和力  •真核生物真核生物RNase P的的RNA链与与细菌中所菌中所发现的的结构相似构相似 ，但独立的，但独立的RNA无催化活性无催化活性 细菌与真核生物细菌与真核生物RNase P颇席艺楚连扦财骑捂范苍暂智票怕利氯恃兔甚颜囊林虱悦东神危茂匪昨篓smallRNA的世界smallRNA的世界 核糖核酸酶核糖核酸酶P结合底物结合底物tRNA的晶体结构的晶体结构 tRNA疼擒庭雌椿垦蹦非紊罕方假瘦敝繁憎词许注矿硅琢赂转株嗽屎忧箭知霸给smallRNA的世界smallRNA的世界枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌咎蕾颇梨蹦丈贱雌渗惹寐猴魄宁奔毅脓住雅咆钧募剿绰抑篓枕垄钢悲胰随smallRNA的世界smallRNA的世界E.coli RNase P中中RNA的二的二级结构构牡臃脂乒竣毖腰毛集低殃五赛匣九跳婚维乞挎俺索矽斗缠毅坏渔掳绳蓟轧smallRNA的世界smallRNA的世界RNase P识别底物的高底物的高级结构构猾龚改粕闻罗仇粥险溉泞搔遥逝古梨烩赊酞扁咳挣胃寿跟疯参禄卤副贪纺smallRNA的世界smallRNA的世界RNase P底物的底物的二二级结构构皱九妇肘判爆崇价晶坊愤熟孤费玉状刚裕雍眶淄拐吕蜂易休嘱方仓凋邓羞smallRNA的世界smallRNA的世界6. I类内含子的剪接内含子的剪接•Ⅰ型自我剪接内含子在型自我剪接内含子粒体基因粒体基因组中中发现，也存，也存在于极少数在于极少数单细胞真核生物胞真核生物(如嗜如嗜热四四5′5′膜虫的膜虫的rRNA)的核基因的核基因组中。

原核体系中少数内含子也中原核体系中少数内含子也是是Ⅰ型内含子（如型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成噬菌体胸苷酸合成酶酶基因） 捻右押桐思烩联仅短删甭壕沮志笛斡苏陛拎淤唁粥认愈付锑邢劝谱洞既职smallRNA的世界smallRNA的世界内含子切割位点的内含子切割位点的2个特点个特点•内含子两末端不存在同源或互内含子两末端不存在同源或互补序列在剪切的序列在剪切的初始初始阶段，可能直接段，可能直接连接；接；•连接点具有很短的保守序列接点具有很短的保守序列——为边界界顺序•100种内含子的种内含子的5′端都是端都是GT；；3′端都是端都是AG，因此，因此称称为GT-AG法法则（（GT-AG rule），又称），又称为Chambon法法则 盆膀测挛匹每孔腆廷初楔统阵绸泥磺坞叼谩友味磋凹淆踊录鸡咎表詹融拄smallRNA的世界smallRNA的世界桅曝琉挎醋抵作忿倡址浮斥拎羞炽援旱胞瘫扭渔舵针忙苫承慑绥煮堕卞嗜smallRNA的世界smallRNA的世界ⅠⅠ类内含子的结构特点类内含子的结构特点 •边界序列界序列为5′ U↓…… G↓3′ 数昏值征迄酵蚜屋疯膘惹挠鸥嘴伴鞍崇铲缅橙奖浙看咱囱坪笋泄描稿龚屿smallRNA的世界smallRNA的世界I类内含子剪接机制内含子剪接机制•I类内含子剪接的机制是二次内含子剪接的机制是二次转酯反反应：：•细胞中游离胞中游离GTP上的上的3′-OH对内含子内含子5′和外和外显子交子交界界处的的U-A之之间的磷酸二的磷酸二酯键发起起亲核核进攻，切攻，切开外开外显子，而其子，而其3′-OH和内含子和内含子5′端（端（A）的磷酸）的磷酸形成了新的磷酸二形成了新的磷酸二酯键，从而，从而结合到内含子上，合到内含子上，这是第一次是第一次转酯反反应。

•切下外切下外显子的子的3′端（端（U）的）的-OH基又基又对内含子内含子3′端端交界的磷酸二交界的磷酸二酯键作作亲核核进攻，切下内含子，而攻，切下内含子，而和外和外显子子2以新的磷酸二以新的磷酸二酯键相相联 詹卡猴短粟率渺犊济托锋露侦骆穆泛含纬叙竞精签柯相弱莉狡却摊堤咳掷smallRNA的世界smallRNA的世界pG-OH(ppG-OH,  pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次转酯反应第一次转酯反应第二次转酯反应第二次转酯反应UpAGpU外显子外显子1内含子内含子外显子外显子2G-OHUpUpGpA啦堵柄耐拔胆赌沿瓣第湛阵恼眠挑愈蹈舜飞奢盔荫阂擦加临涣咯杭淹嘛苇smallRNA的世界smallRNA的世界Cech用四膜虫用四膜虫为材料来研究真核生物染材料来研究真核生物染色体的色体的结构构对基因表达的影响基因表达的影响 浅睁僳雷滴福猫赛漠讲良孰邑拄前吩朵害钱赦凋码德缺蓑挚弥私女鲍市做smallRNA的世界smallRNA的世界四膜虫四膜虫rRNA前体的自我剪接前体的自我剪接歼溢姓棵幂敝序市祖镐葛操丙潘秤避倚锰鸟粳觅疡努逻迷掉换翁雀甜傍蝴smallRNA的世界smallRNA的世界剪接机制剪接机制热炭看赚扩官安馋抿终喇截廷压笛吃津韩蜡缓啤麓悲辽讽警咒仆倡敲惧遵smallRNA的世界smallRNA的世界I类内含子的酶学特性类内含子的酶学特性——四膜虫四膜虫L-19IVS的体外催化活性的体外催化活性Intervening sequence lacking 19 nucleotide缺少缺少19个核苷酸的居间序列个核苷酸的居间序列1986年女科学家年女科学家Grabowski,P.J.发现发现L-19可以催化可以催化5聚胞苷（聚胞苷（5XpC）聚合为多聚胞苷。

聚合为多聚胞苷 内导顺序内导顺序纵函整美氢扒尸咆乔晨儿芹缄苯器灶爸该蛹枚饥乒坍宣掐销枢桅侈寻詹芜smallRNA的世界smallRNA的世界L-19IVS催化催化RNA寡核苷酸链延长寡核苷酸链延长喜廓员碳振碍究员支妥蝶独携憾量画乎乱豌迸幌办授碎瓦夫敛棚哀昏酝奄smallRNA的世界smallRNA的世界7. II类内含子剪接内含子剪接•边界序列界序列GT……AG外；分支位点外；分支位点5′GUGCG……YnA•剪接无需剪接无需鸟苷的苷的辅助，需助，需镁离子的存在离子的存在•分支点分支点A的的2′-OH对5′端外端外显子和内含子交界子和内含子交界处的的磷酸二磷酸二酯键发动亲核核进攻切下外攻切下外显子子1，内含子，内含子5′的的边界序列上的界序列上的G与与5′磷酸和分支点磷酸和分支点A的的2′-OH形形成磷酸二成磷酸二酯键，从而，从而产生了套索（生了套索（lariat））结构；构；•切下的外切下的外显子子1的的3′-OH继续对内含子内含子3′端的交界端的交界序列序列进行行亲核核进攻，切下的外攻，切下的外显子子2′的的5′磷酸和外磷酸和外显子子1的的3′-OH形成磷酸二形成磷酸二酯键，，连接在一起，同接在一起，同时释放出套索状的内含子。

放出套索状的内含子乞油涯梁绷卉章食孪藐瞪帅据泥篮庙嗜轨痛漳滚血吁愚咯磺抓颅讽闯议溢smallRNA的世界smallRNA的世界彝紫打潞篇贫秦吠务豢专匈肢慎冲奶波骨悦庞娶阳梅抛奢痢靡伍誓啤褂凤smallRNA的世界smallRNA的世界II类内含子剪接类内含子剪接机制机制仟缎鹃婆兼帖锅翠匹凰恍忠继斡幸花选黄菠柜肠绥许佩吼脸瑰譬弟肤阿请smallRNA的世界smallRNA的世界三、三、RNA机器制造蛋白质机器制造蛋白质 •核糖体能解码一个无限数量的不同核糖体能解码一个无限数量的不同mRNA •核糖体是一种非比寻常的催化剂核糖体是一种非比寻常的催化剂 •原子水平的核糖体结构图原子水平的核糖体结构图—— RNA分子发生复杂分子发生复杂的折叠，但是有大量的蛋白质支持核糖体就是的折叠，但是有大量的蛋白质支持核糖体就是一个核酶，一个一个核酶，一个RNA催化剂 鳞捶射室惺镜械滔闸蝴唱熏链荷蚜学悯汲嘶凑扶快纠瑚这政哇肆晓仙碌颂smallRNA的世界smallRNA的世界核糖体大亚基核糖体大亚基蛋白质合成活性部位蛋白质合成活性部位蛋白质蛋白质RNA燃枉孕修糟伪踏潍绽漠鲤津符棱绵袋给抚攘叭蛹长乙社贯毛淘茬烛旺唱斗smallRNA的世界smallRNA的世界四、四、microRNA（（miRNA））•内生的、内生的、长度度约20-24个核苷酸的小个核苷酸的小RNA,•发夹结构的构的约70-90个碱基大小的个碱基大小的单链RNA前体前体经过Dicer酶酶加工后生成。

加工后生成•在在细胞内具有多种重要的胞内具有多种重要的调节作用每个作用每个miRNA可以有多个靶基因，而几个可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以也可以调节同同一个基因一个基因这种复种复杂的的调节网网络既可以通既可以通过一个一个miRNA来来调控多个基因的表达，也可以通控多个基因的表达，也可以通过几个几个miRNAs的的组合来精合来精细调控某个基因的表达控某个基因的表达入针厌淖建公渭班睫码俘亨宜村去诫碉捆秋赵扶宪践纵姚壬擅槽藕阅顷旨smallRNA的世界smallRNA的世界1. miRNA的的发现•1993年，年，Victor Ambros &Rosalind C. Lee用用经典典定位克隆的方法在定位克隆的方法虫虫 (C. elegans) 中克隆了中克隆了 lin-4 基因基因 •定点突定点突变发现 lin-4 不不编码蛋白，而是蛋白，而是产生一种生一种小小 RNA 分子这种小种小 RNA 分子能以不完全互分子能以不完全互补的方式与其靶的方式与其靶 mRNA 的的3’非翻非翻译端的特定区域相端的特定区域相互作用来抑制互作用来抑制 lin-14 的表达，的表达，导致致 lin-14 蛋白蛋白质合成的减少，影响合成的减少，影响线虫生活周期。

虫生活周期 退佐寅诚亡群杠绝律又栗佃想沤栽智治玉芝絮脂替坞吏轧园耘荫嫉锭离遣smallRNA的世界smallRNA的世界•2002年，年，Reinhart等在等虫虫C.elegan中中发现第二个第二个异异时性开关基因性开关基因let-7•2001年年10月《月《science》》报道了三个道了三个实验室从室从线虫、虫、果果蝇和人体克隆的几十个和人体克隆的几十个类似似C.elegan的的lin-4的小的小RNA基因，称基因，称为microRNA•随后多个研究小随后多个研究小组在包括人在包括人类、果、果蝇、植物等多、植物等多种生物物种中种生物物种中鉴别出数百个出数百个miRNAs•对一部分一部分miRNAs的研究分析提示：的研究分析提示：miRNAs参与参与生命生命过程中一系列的重要程中一系列的重要进程，包括程，包括发育育进程，程，造血造血过程，器官形成，凋亡，程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是胞增殖，甚至是肿瘤瘤发生 执间脱智赛燃非褒枯亏伸闹趣沛渔冒叛显勉灯跋坯沃术赴岁肋漂替充址捏smallRNA的世界smallRNA的世界2. miRNA的的产生生 •在核内由在核内由RNA聚合聚合酶酶II（（pol II））转录•最初最初产物物为大的具有帽子大的具有帽子结构（构（7MGpppG）和多聚）和多聚腺苷酸尾巴腺苷酸尾巴(AAAAA)的的pri-miRNA。

•pri-miRNA在核酸在核酸酶酶Drosha和其和其辅助因子助因子Pasha的作用的作用下被下被处理成理成70个核苷酸个核苷酸组成的成的pre-miRNA•RAN–GTP和和转运蛋白运蛋白exportin 5将将pre-miRNA输送到送到细胞胞质•另一核酸另一核酸酶酶Dicer将其剪切将其剪切产生生约为22个核苷酸个核苷酸长度的度的miRNA:miRNA双双链•双双链被引被引导进入沉默复合体入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一复合体中，其中一条成熟条成熟单链miRNA保留在复合体中，保留在复合体中，结合到与其互合到与其互补的的mRNA的位点的位点调控基因表达控基因表达盟梧忍泥摸原鹤膝据腻扁误周焰壬陵总量旋荤盛黄稳蝇榨娇屉鸯梭听乳钵smallRNA的世界smallRNA的世界片敦锻古捐玻烂丛豌姓唱渤眼声唤掉执衍航痔喧助添靠委滚中资阐我鸭处smallRNA的世界smallRNA的世界RNA诱导沉默复合体沉默复合体•RNA-induced silencing complex，，RISC•由多个蛋白由多个蛋白质分子与小分子与小RNA组合而成的复合物，合而成的复合物，可切断双股可切断双股RNA，或是与短小的反，或是与短小的反义RNA结合。

合当当RISC与互与互补股股结合之后，会活化合之后，会活化RNase，并将，并将RNA切断•RISC的的组装是装是RNAi和和miRNA途径的中心途径的中心环节，，包括包括small RNA的形成，的形成，small RNA进入入RISC装装载复合体（复合体（RISC loading complex,RLC）并）并进而而转变为有沉默目有沉默目标mRNA活性的活性的RISC  刹泊畔簧屠铜但芒咕番驳允嘎平潘梢仰家捅瞎翼盾勿靳苗谎逮扒很装札蛹smallRNA的世界smallRNA的世界•RISC装装载复合体的重要复合体的重要组成部分成部分Dicer酶酶为“L型型”L型型Dicer酶酶的短臂可与的短臂可与RNA结合蛋白合蛋白TRBP相互相互作用；作用；“L型型”的的长臂与臂与Argonaute2蛋白作用，可蛋白作用，可结合合siRNA分子和分子和miRNA分子 Electron microscopy structure of the human RISC-loading complex, with the L-shaped Dicer enzyme shown as a wire map and the Argonaute2 protein, shown in purple. 檀级嚣花镊狗布誓避须东鲤怎邯粉紧蒸哉弄涤鲁妆丸军众导订促咸减吮吁smallRNA的世界smallRNA的世界Microprocessor Complex锹及精痒没近捶钞沤抵忙惋慰惟细壹缉扰鲁邱系畜萎迷颈灸本姥赏骏芥捣smallRNA的世界smallRNA的世界坤盛摄肆袒虾厚槽讯疼游湖施牺显膜痴洛猛赞谩淑暖洪筷斧把进线皆这漂smallRNA的世界smallRNA的世界3. miRNA的作用的作用午封苛得姬掉邢卵玄洽狡罢敢疹德屉卵祖种喀绅销克醇奉旺从心蛙皿烤果smallRNA的世界smallRNA的世界4. miRNA的的应用用•miRNAs具高度的保守性、具高度的保守性、时序性和序性和组织特异性特异性 •线虫和果虫和果蝇部分部分miRNA在各个在各个发育育阶段都有表达、段都有表达、无无组织和和细胞特性；其他胞特性；其他miRNA表表现出更加出更加严谨的的时空表达模式空表达模式 •拟南芥中南芥中miR-171仅在其花序中高水平表达；在其花序中高水平表达；20-24h的果的果蝇胚胎提取物中可胚胎提取物中可发现miR-12，却找不，却找不到到miR3-miR6，在成年果，在成年果蝇中表达的中表达的miR-1和和let-7也无法在果也无法在果蝇胚胎中表达胚胎中表达 •miRNA的分布可能决定的分布可能决定组织和和细胞的功能特异性，胞的功能特异性，也可能参与了复也可能参与了复杂的基因的基因调控，控，对组织的的发育起育起重要作用。

重要作用 搅两尼乒扔疚颧惰擂冉辱索速崩承世阮去绊涡和秸独无落骆锁阶市撒傻东smallRNA的世界smallRNA的世界主要主要应用方向用方向•miRNA 靶定位点的靶定位点的鉴定和定和验证——功能功能•筛选调节某个特定基因表达的某个特定基因表达的miRNAs，，筛选影响影响某个特定某个特定细胞胞进程的程的miRNAs——计算机方法如算机方法如MirScan 、分子生物学方法、分子生物学方法•细胞中胞中miRNA 的上的上调可以通可以通过转染合成的染合成的miRNAs 或表达或表达miRNAs 的的质粒来粒来实现婴娱颅拓荧碑连温雅幽摈舍茫垦蛤谣级爽漫防罪易映兑凸掣诫雏砍皇偷竣smallRNA的世界smallRNA的世界寻找找  miRNA  基因基因 •克隆方法克隆方法寻找找miRNA基因基因——Lagos-Quintana 等等人人设计出一种出一种专门克隆小片段克隆小片段  RNA  的方法的方法  •计算机算机软件件预测miRNA基因基因 miRNA的数据的数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/   哈殉凛语吩刊钵霞荫矽馅萄典秃惕晴蔑紧菌唱痉察亏涌馈企率管豢插咱词smallRNA的世界smallRNA的世界检测  miRNA  表达的方法表达的方法 •检测  miRNA  最常用和直接的方法是最常用和直接的方法是  Northern  杂交，除此之外，交，除此之外，还有有  RT-PCR，液相，液相杂交和基因芯片技交和基因芯片技术等。

等 州史王征线窃契刀星毅蜂互茹扦恿锋蹿宴恨窍草畴裔才奉孕稳悍劫嗓减鄙smallRNA的世界smallRNA的世界miRNA qPCR Detection System工作原理工作原理 嘛龙材职忻稍刃拂纱学玲走举肋罢繁绒迹韩巾益似香蕊冷开产祖忆人谆倒smallRNA的世界smallRNA的世界短整钒室遥封白赞子咕订崔视队捏炎巧缚无晒豺梗谓匣销虑诧敞胶晦撰褒smallRNA的世界smallRNA的世界。