艾滋病实验室检测管理与设备维护.ppt

艾滋病实验室检测管理与艾滋病实验室检测管理与 设备维护设备维护河北省疾病预防控制中心性病艾滋病预防监测中心赵翠英HIVHIV抗体检测的目的抗体检测的目的 l监测:以监测为 目的的检测 是为了 解不同人群HIV感染率及其变化趋势 而进行的检测 ，检测 的人群包括各 类高危人群和一般人群l诊断:以诊断为目的的检测 是为了 确定个体HIV感染状况而进行的检测 ，包括临床检测 和自愿咨询检测 、 术前检测 、根据特殊需要进行的体 检等 l血液筛查: 以血液筛查为 目的的检 测是为了防止输血传播HIV而进行 的检测 ，包括献血员筛查 和原料血 浆筛查 HIVHIV抗体检测的要点抗体检测的要点l筛查试验阳性不能出阳性报告l严格遵守实验室标准操作程序（SOP ）l严格按照试剂盒说明书操作l注意防止样品间交叉污染常规程序 • 初筛-复检-确认 复检： 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂 和另外一种不同原理或不同厂家的筛 查试剂重复检测如两种试剂复测均 呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性； 如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送 艾滋病确认实验室进行确认HIV抗体筛查试验流程图 HIV抗体确认试验流程图 一、一、HIVHIV抗体诊断抗体诊断l临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体 ，包括初筛和确认两个方面。

HIV抗体一 般在感染后几周逐渐出现，可延续至终 身，是重要诊断依据，但是从感染到血 清抗体阳转有一段窗口期，平均为1到3 个月，还有一小部分比例的HIV感染者出 现迟缓反应，95%以上HIV-1感染者产生 抗体的时间是在感染后6个月以内常用样品常用样品主要为血液此外还可用唾液检测HIV（Orasure，如Salivacard），尿液检测HIV抗体 常用方法常用方法l酶联免疫吸附试验（ELISA）l明胶颗粒凝集试验（PA）l斑点免疫试验（或免疫层析）：胶体金 或胶体硒双抗原夹心双抗原夹心ELISAELISA试验原理试验原理▲ 此类试验比较敏感和特异，可检 测血清中的IgA、IgM、IgG抗体▲ 将HIV -1/2混合抗原包被在微孔板 底部  “一步法”--实验时加入待检血清和辣根 过氧化物酶标记HIV-1/2混合抗原  “二步法”--实验时先加入待检血清，温 度处理后，再加酶标记HIV-1/2混合抗原双抗原夹心双抗原夹心ELISAELISA试验原理试验原理▲ 温度处理后洗涤待检血清中如有特 异性抗体，即将包被抗原和酶标记的抗 原桥联在一起，如无抗体，通过洗板而 洗去酶标记的混合抗原。

加入的底物同 被桥联抗原上的酶发生颜色反应，指示 抗体存在，如无抗体参与则无显色 ▲ 实验中设阴性对照和阳性对照明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验( (PA)PA)原理原理以HIV抗原致敏粉红色明胶粒子(载体) 这种致敏载体和血清中HIV抗体相遇被 桥联而出现肉眼可见的凝集反应,非致敏 的明胶粒子因无抗原参与,则不发生凝集 如果试验中的未致敏粒子对照出现凝 集，即提示血清中含非特异性凝集因子 ，需用未致敏粒子吸附处理，重新做试 验 目前已有HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV 1/2 PA）和HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（AERODIA-HIV-1/2）前者可用于HIV1/2的筛查，后者可用于区分HIV-1型和HIV-II型其缺点是判定结果用肉眼观察，无法保存 目前这问题已得到解决，为了保存试验结果，试剂盒可配备数码相机雅培雅培DetermineDetermine（（硒标）硒标）快速试剂试验原理快速试剂试验原理雅培Determine HIV1/2快速测试 试剂是一种用免疫层析法原理,定性 测定血样中HIV1/2抗体加样本入反应条，当样品通过硒胶体- 抗原结合物时，与硒胶体-抗原结合物混 合重组结合，此混合物继续迁移通过固 相包被的合成肽和重组抗原的结果窗。

如果样品中含有HIV1/2抗体，其抗体将 会与硒胶体-抗原结合，并在窗口处被固 相包被的合成肽和重组抗原所捕获固定 ，形成一条红线如果样品中不含 HIV1/2抗体，则无红线形成为了保证结果有效，在反应条中含有 质控条带金标快速试剂试验原理金标快速试剂试验原理CHEK HIV-1+2 （EY）将HIV抗原吸附在基膜上，加入待检 标本后,如果标本中有HIV-1或HIV-2抗体 ，抗体便被吸附在基膜的抗原上，加入P -A金标记溶液，而其Fc部位则和P-A金标 记物结合, 形成如三明治般的粒子，出 现肉眼可见的粉红色圆点 窗口期和残余危险度窗口期和残余危险度1、窗口期：HIV感染后至抗体检出前的一段时间称 为窗口期 2、残余危险度(residue risk)：在目前条件下，筛查后 仍具感染性的机率影响残余危险度的主要因素 包括窗口期、试剂质量、实验室质控以及人群感 染率等各国的残余危险度不一，美国1985年是 1/2500,随着检测试剂完善，包括“O”亚型的检出、 IgM和p24抗原的检测，到1995年降至1/44-66万； 据报道非洲为5/1000,泰国1/775,肯尼亚 1/50二、艾滋病病毒的抵抗力二、艾滋病病毒的抵抗力HIV抵抗力lHIV一旦离开宿主在外界环境中生存 能力便很快消失，HIV对环境中的物 理因素和化学因素抵抗力均较弱， 比乙肝病毒（HBV）的抵抗力低得多 。

因此，对HBV有效的消毒和灭活方 法均适用于HIVHIV抵抗力--物理因素物理因素lHIV对热很敏感，对低温的耐受 性强于高温因此，可以用高温 灭活HIV，在低温条件下保存HIV l对紫外线不敏感：用紫外线、γ 射线不能灭活HIVHIV抵抗力--物理因素物理因素l HIV灭活：美国疾病控制中心证明，在干燥环 境中的HIV 浓度在几小时之内降低90～99% （ 即降低1～2 log ）在室温（22～27℃）液 体环境下HIV可存活15天以上；经56℃处理30 分钟，可使HIV在体外对人T淋巴细胞失去感染 性，但不能完全灭活血清中的HIV；血清中HIV 经过60℃3小时或80℃30分钟作用后不能检出 感染性HIV目前，世界卫生组织推荐的逆转 录病毒灭活方法是100℃20分钟 HIV抵抗力--物理因素物理因素lHIV保存：l在-70℃不加保存剂冷冻保存，其感 染性可丧失但若在-70℃保存于 35%山梨醇或50%小牛血清（FBS）可 存活3 个月以上，在液氮中（- 196℃）HIV可存活数年以上因此 ，毒种必须置于液氮中方可长期保 存 HIV抵抗力—化化学因素学因素lHIV耐碱不耐酸：在pH3.0条件下HIV 滴度在10分钟钟可下降4个对对数级级，而 pH值值高达9.0时时，HIV滴度下降甚微 。

l对含氯消毒剂敏感0.5％次氯酸、 2％戊二醛溶液、3％碘酒、6％过氧 化氢可在3～5分钟内灭活HIV实验常用的消毒办法实验常用的消毒办法l高压蒸汽灭菌 (121℃ 20分钟)l干烤 170℃ 2小时l煮沸 20分钟l消毒剂浸泡30分钟，常用消毒剂为5％可 用氯(次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨T)、6 ％过氧化氢、2％戊二醛等70%酒精1分 钟可灭活HIV三、三、HIVHIV实验室检测管理实验室检测管理艾滋病检测工作规范要点艾滋病检测工作规范要点l实验室设置国家艾滋病抗体检测参比中心艾滋病抗体确证实验室--卫生部批准艾滋病抗体初筛中心实验室--卫生厅审批艾滋病抗体初筛实验室--卫生厅审批l各级实验室承担相应的任务确证实验室职责确证实验室职责l对初筛实验室人员技术培训l对初筛实验室考评或验收l对初筛实验室进行年度质控血清考核l评估省内所使用的HIV抗体检测试剂l省内各级初筛实验室的质控管理l艾滋病抗体初筛实验阳性标本的确证l向上级部门报告检测工作艾滋病抗体初筛中心实验室职责艾滋病抗体初筛中心实验室职责l本地区初筛实验室的技术指导和管理l本地区初筛实验室人员的技术培训和咨询l本地区初筛实验室的质量管理和质量控制l对初筛实验可疑阳性或阳性标本的复检l承担艾滋病抗体的初筛实验和咨询l汇总本地区艾滋病检测结果并上报初筛实验室的职责初筛实验室的职责l艾滋病抗体初筛实验和检测前后的咨询l及时向中心实验室送检初筛实验阳性或 可疑阳性标本以及需做确证实验的标本l作好本实验室的各项管理，如标本登记 、实验记录、安全记录等。

l按规定向上级报告实验室工作和检测的 阶段总结初筛实验室的基本条件初筛实验室的基本条件l房屋--清洁区、半污染区、污染区，控温l设备--酶标仪、洗扳机、冷藏，微机，高压灭 菌器、生物安全柜、洗眼器等l人员--3名以上技术人员，含1名中级以上 技术职称全部须经专业技术培训l质量保障措施l安全保护措施--环境、个人l具备各项规章制度HIVHIV抗体检测实验室结构示意抗体检测实验室结构示意1 1HIVHIV抗体检测实验室结构示意抗体检测实验室结构示意2 2HIVHIV抗体检测实验室结构示意抗体检测实验室结构示意3 3人员防护的基本装备人员防护的基本装备l隔离衣（一次性）l帽子l口罩l眼镜（依据个人视力配置，不准移出实 验室l能保护脚面的、便于消毒、清洗的实验 室用鞋生物安全柜生物安全柜微生物安全柜 microbiological safety cabinet (MSC)生物安全柜biological safety cabinet（ BSC） 操作危险性微生物时所用的箱形空气净化 安全装置，保护使用者和环境不受因为 操作产生的有害危险物质和微生物气溶 胶的伤害生物安全柜按防护水平分为I 级、II级、III级。

为什么使用生物安全柜 1.生物安全柜主要用于各种微生 物,特别是有害微生物的操作和 基因工程操作 2.根本目的是保护工作人员健康 和柜外环境安全 3.根据保护对象和程度的不同， 生物安全柜分为I、II和III级 生物安全柜的分级生物安全柜的分级l1. I级生物安全柜：保护工作人员l和环境l2. II级生物安全柜：保护工作人员l 、环境和样品l3. III级生物安全柜：采用手套箱更l严格地保护工作人员、环境和试样l（产品）II II级生物安全柜分类级生物安全柜分类l1.II级A型生物安全柜：70%柜内循环，l30%空气排出，无连接法蓝l2.II级B1型生物安全柜:30%柜内循环，l3.II级B2型生物安全柜:100%空气排出l4.II级B3型生物安全柜：70%柜内循环，l30%空气排出，有连接法蓝l5.II级A/B3型生物安全柜：兼顾A型和lB3型生物安全柜的选用生物安全柜的选用l1. 凡进行有害微生物和转基因操作，l均应使用生物安全柜，不可用净化l工作台l2. 根据工作性质和防护要求，选用l适当级别和型号的生物安全柜l3. 产品质量l4. 售后服务微生物防护性能微生物防护性能l1.对工作人员的防护性能l2.对样品防护性能l3.交叉污染防护性能初筛试剂要求初筛试剂要求* HIV－1/2混合型 * 卫生部批准文号 * 卫生部药政局检定所批批检,并贴有防伪标签 * 进口初筛试剂要有我国的注册证明 * 敏感性高、操作简便、价格低廉和相对好的特 异性, * 常用初筛试剂:酶联免疫吸附试验、凝聚试验、 免疫斑点试验等。

艾滋病抗体检测结果的报告艾滋病抗体检测结果的报告l初筛试验结果:* 初筛实验室HIV抗体检测的阴性结果，可以出 据试验阴性的报告单，并标明所用试剂名称、 试剂效期、试验者等内容可通过咨询通知本 人 初筛HIV抗体阳性，只视为HIV抗体可疑阳性 ，初筛实验室无权向个人或送检单位报告阳性 结果可出据“HIV抗体待复查”报告需再 次采血送确认实验室作确认试验艾滋病抗体检测结果的报告艾滋病抗体检测结果的报告l确认试验结果:* 阳性结果，只有卫生部批准的HIV抗体 确认实验室有资格出据阳性报告，同时 按照疫情报告程序和要求呈报有关部门 ，并经充分分析具体情况决定通知受检 者* 阴性结果，将阴性结果报给送检单位， 可以通知受检者HIVHIV抗体检测情况报告抗体检测。