14基因诊断及基因治疗.ppt

1,第二十一章 基因诊断与基因治疗,2,第一节 基因诊断,一、基因诊断的含义 基因诊断（gene diagnosis）亦称分子诊断、DNA诊断采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断3,二、基因诊断的原理及方法,1 基因诊断的原理检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常2 基因诊断的方法（1）DNA诊断（2）RNA诊断,4,（1）DNA诊断1）限制性片段长度多态性2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）3）单链构象多态性（SSCP）4）DNA序列分析（2）RNA诊断1）RNA印迹（Northern blot）2) RT-PCR,5,1）限制性片段长度多态性—基因连锁分析,（1）方法原理：待测DNA序列中的点突变导致了某一限制性内切酶识别位点的改变可引起其特异的限制性内切酶片段的大小与多少随之改变，即而通过Southern印迹杂交和限制性内切酶酶谱分析诊断出点突变6,6,（2）诊断原理 在人群中，个体间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。

DNA多态性可以改变限制性内切酶的切割位点，产生DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment lenth polymorphism, RFLP）7,7,,RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一种致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种遗传性标志来判断家族成员或胎儿的基因组中是否携带致病基因8,8,9,9,（2）应用 A sickle-cell anemia 的基因诊断 a. 病因 血红蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸10,10,,1,2,3,4,5,6,11,11,b. 检测 限制性内切酶： Sau1 酶切位点： CCTNAGG 探针： 标记的β珠蛋白,12,12,c. 结果分析 切割正常待测血红蛋白β珠蛋白，DNA与探针杂交后产生1.1kb 切割异常待测血红蛋白β珠蛋白，DNA与探针杂交后产生1.3kb,13,13,,14,14,,,15,15,（1）原理 根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于突变基因异 常核苷酸序列的寡核苷酸作为杂交探针，从而直接检测和鉴定突变基因。

2）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法 （allele specific oligonucleotide, ASO）,16,16,,相应于突变基因异常 相应于正常基因核苷酸序列的寡核苷 核苷酸序列的寡核苷杂交探针 酸杂交探针,,与受检者DNA 进行分子杂交,发生杂交 均可杂交 与异常 不发生杂交 (突变纯和子 ） （杂和子） 与正常发生杂交(正常纯和子 ）,,,,17,17,,18,18,1）病因H-ras （化学诱导） ras家族 K-ras 编码P21蛋白 N-ras （自然发生)ras家族点突变好发于 12、13、61位密码子,,,（2）应用 —大肠癌K-ras 的基因诊断,19,19,2）检测 a、PCR扩增 用人工合成的位于待测点突变两侧的引物，分别扩增含12、13、及61位点的基因片段20,20,b、ASO分析 ① 将扩增产物结合在尼龙膜上分别与ras原癌基因密码子12、13、61所有可能引起碱基突变的寡核苷酸探针进行杂交； ② 杂交后，膜经严格的洗涤，仅允许完全相配的杂交双链存在； ③ 针结合处在光胶片上呈阳性斑点,21,22,22,3）mRNA的检测 （1）原理 通过对mRNA进行定量、检测其 剪接加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能否转录、转录物（mRNA）是否正常以及转录效率的高低。

23,23,*mRNA不稳定可将其转为cDNA再用PCR技术进行研究（RT-PCR）,24,24,（2）应用,视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷Rb1基因的mRNA全长4.7kb采用RT-PCR技术分析外显子突变或mRNA前体剪接异常25,25,分析外显子19至22间的基因突变 逆转录引物：外显子22反义链序列 5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3 ` PCR引物: 外显子22正义链序列 5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3` 外显子19正义链序列 5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`,26,26,用RT-PCR检测艾滋病,27,三、基因诊断的应用,1. 遗传疾病的诊断产前诊断、遗传病易感性2 感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他,28,3 恶性肿瘤4 法医学中应用,29,（1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting）可变串联重复序列  小卫星DNA（variable number of tandem repeat, VNTR）,30,,（2）短串联重复（short tandem repeat, STR）多态性分析微卫星DNASTR—PCR,31,第二节 基因治疗的基本概念和基本策略一 基因治疗（gene therapy）的概念 1、背景与历史疾病的分子生物学了解新技术新方法（特别是重组DNA）的迅速发展,32,1989年5月28日 第一个基因标记计划 （TIL-NeoR） 1990年9月 11日 第一个基因治疗计划 （ADA-SCID）,33,1995年NIH组织 Orkin 、Motoksy对 头5年基因治疗评估3点 建议： 发展载体技术疾病的分子机制动物模型 成立3个国家实验室 2000年2月 532个计划，3400余个病人,34,病种：恶性肿瘤 62.2% 遗传性疾病 13.3% AIDS 6.8% 心血管疾病 6.8% 其他 1.3 %,35,2、定义基因角度： 正常或有功能的基因置 换或增补缺陷基因。

治疗角度： 新的遗传物转移到某个体获治疗效果36,3、方式 基因矫正和置换: 同源重组 基因增补: ADA、 血友病 基因封闭: myc基因过度表 达，反义抑制 活化前体药物基因治疗：,37,,单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因导入肿瘤细胞合成HSV-TK无毒性的抗病毒 有毒性的抗病毒药物（GCV） 药物（GCV 三磷酸）细胞死亡,,,,,,38,4、导入方式 ex vivo 基因转移 in vivo 基因转移,39,,第三节 基因治疗的条件1、 目的基因的种类：细胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受体基因,40,1、 目的基因的获得方法 1） 真核基因组DNA文库中 目的基因的克隆 2） cDNA文库中目的基因的 克隆 3） 人工合成基因片段 4） PCR法筛选扩增目的基因,41,1、 外源基因的要求 1） 含信号肽的cDNA，序列 正确 2） 必要的调控元件（顺式 作用元件 启动子、增强 子、静止子）,42,3） 外源基因进入细胞核转录， 再转移至细胞浆，间隔序 列（内含子），剪接信号 （SA,SD）PolyA信号，核 内转录因子 4） 翻译的起始密码子、终止 密码子、内核糖体进入位 点（IRES）元件 5） 外源基因的丢失、失活、甲基 化,43,4、基因治疗的靶细胞（target cell）1） 生殖细胞全世界受严格控制2） 体细胞选择的标准：A、 容易取出和移植B、 容易体外培养C、 目的基因高效导入D、 细胞寿命长,44,常用靶细胞； 自体、 同种异体、 异种、 淋巴、骨髓、皮肤、肝、肌、 肿瘤细胞等,45,,46,基因导入的方式： ex vivo——体外将基因导入target cell ,然后将此修饰过 的细胞回输给病人。

In vivo——外源基因直接导入体 内有关的组织器官47,3、 基因导入（转移）的工具与方法将外源基因或DNA片断导入宿主细胞进行扩增或表达，需要有一个能在该宿主细胞进行复制和表达的载体（vector）来携带前者与后者在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞48,1）非病毒方法,49,,,,50,（一）磷酸钙转染技术磷酸钙--DNA导入细胞吞噬体转运细胞器瞬时 稳定 外源基因存在 外源基因非特异 于染色体DNA外 与宿主染色体DNA重组12小时内表达持续约3-4天降解 稳定转化细胞株,,,,,,,51,（二） DEAE-葡聚糖转染技术（略）,52,（三）脂质体转染法 （20%）聚阳离子脂质体-DNA脂质体DNA阳离子复合物负电荷的细胞膜吸收此复合物 （融合吸收） 优点：简便、低毒性、无免疫原性、无病毒产生、化学成分已知可 大量商业供应 缺点：转染效率低，短暂表达,,,53,（四）电穿孔转染技术 靶细胞（悬浮态）+外源目的DNA 电穿孔仪 高压电脉冲 靶细胞膜发生瞬时可逆性破裂 形成微孔 外源目的DNA进入靶细胞,,,54,（五）基因枪技术 电子发射装置或高压气流金或钨颗粒包裹外源目的DNA形成“子弹”打入靶细胞,,,55,上述物理、化学方法转移基因 的缺点： 1） 转移效率低，多应用于实 验研究 2） 维持时间短 2、 病毒方法,56,在以基因治疗为目的的载体系统中，以病毒载体最为常用，其优点：1） 易于改造与操作2） 转移效率高3）较高的靶细胞特异性,57,病毒载体： 逆转录病毒(retrovirus)载体 ————用于具有分裂功能的 细胞中进行基因转移 与表达,58,,腺病毒 (adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated- virus—————用于非增殖性细胞中进行基因转移与表达,59,（六）逆转录病毒载体 1、逆转录病毒的结构 由2条相同的38S单链 RNA组成 2、逆转录病毒的生活周期,60,。