ALS基因mRNA在白念珠菌不同生物状态的表达论文.pdf

A L S 基因m R N A 在白念珠菌不同生物状态的表达摘要目的通过对酵母状态和芽管状态的白念珠菌A L S 基因m R N A 表达水平的比较，以及对浮游状态和生物膜状态的白念珠菌A L S 基因m R N A 表达水平的比较，探讨白念珠菌A L S 基因m R N A 在白念珠菌芽管及生物膜形成中可能发挥的作用，为防治白念珠菌感染提供重要的理论依据方法选取4 株标准株白念珠菌和1 1 株临床株白念珠菌进行实验研究白念珠菌酵母状态的培育和芽管状态的诱导以及浮游状态和生物膜状态白念珠菌的制备：G S B 培养基，2 5 ℃振荡培养4 8 h ，收获酵母状态的白念珠菌；p h 7 ．0 的R P M I ．1 6 4 0 液体培养基，3 7 “ C 振荡培养3 h ，收获芽管状态的白念珠菌；体外在6 孔细胞培养板上，R P M I ．1 6 4 0 液体培养基，3 7 ℃静置培养4 8 h ，收获生物膜状态的白念珠菌热酸性酚法抽取不同生长状态白念珠菌的总R N A ，R N A 的纯度经紫外分光光度计A 2 6 0 ，A 2 8 0 比值估计，R T ．P C R 两步法逆转录A L S 2 基因m R N A 、A L S 3 基因m R N A 以及A C T l 基因m R N A ，c D N A 扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

利用Q u a n t i t yO n e 电泳分析软件对A L S 2 基因和A L S 3 基因的c D N A 扩增条带进行分析，应用S P S S l l ．5 医学统计软件包的计数资料配对样本差值均数的t 检验对实验数据进行分析( 以P 2 ．2 时，说明R N A 已经被水解成了单核苷酸，均应重新提取3 ．4 c D N A 合成参照反转录试剂盒要求的标准条件进行R N A 反转录，稍加调整，按下列组成配置反转录反应液：I O x R TB u f f e rR N a s ei n h a b i t o r ( 4 0U ／, - 1 )d N T P ( 各1 0 m M )R N a s ef r e ed H 2 0O l i g o d T - A d p t o rP r i m e r ( 2 ．靴M )M g C I ．, 2 ( 2 5 m M )A M V 反转录酶( 5 u 版1 )R N A 模板2 吮l 反转录体系混匀，瞬间离心将上述反应体系放入P C R 仪中，按以下条件进行反转录反应反转录反应条件：4 2 ℃，6 0 m i n ——一9 9 ℃，5m i n ——一4 ℃，5r a i n 。

反转录所得c D N A 作为P C R 反应的模板，瞬间离心，置．2 0 ．O ℃冰箱保存备用3 ．4 引物的设计合成试验用目的基因的引物参照文献【7 l 设计，选用在白念珠菌表达相对稳定的A C T l基因1 1 2 】作为内对照基因，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列以及P C R 产物长度见表1 7拟吲驯删埘伽埘叫材料与方法表1R T - P C R 寡聚核苷酸引物序列及扩增产物的长度基因引物序列P C R 产物长度退火温度5 ’p r i m e rC C A G C T T I C T A CG T ] “ T C C2 0 9 b p37p r i m e rC T G T A A C C A C G T T C A G A CA L S 25 ’p r i m e rC C A A G TA T rA A C A A AG T I “ T C A A T CA C TT A T3 6 6b p37p r i m e r T C T C A A T C T T A A A T F G A A C G GC T I ' A CA I _ S 357p r i m e r C C A C T T C A C A A T C C CC A T C3 4 2b p3 ’p r i m e rC A G C A GT A GT A GT A AC A GT A GT A GT T T C A TC5 6 ℃5 8 ℃5 8 ℃3 ．5 聚合酶链反应( P C R )参照试剂盒要求的标准条件进行P C R 扩增，稍加调整，按下列组成配置P C R反应液：P C R 反应体系组成：5 x P C RB u f f e rc D N A 模板上、下游引物( I O ／[ z M )灭菌双蒸水T a q D N A 聚合酶( 5u 仉1 )混匀，瞬间离心按以下条件进行P C R 反应：9 5 ℃，5 r a i n ，预变性；9 5 “ C 变性，3 0 s e c ’1退火温度，3 0 s e c 孓7 2 ℃延伸，3 0 s e cJ83 5 个循环青岛大学硕：L 学位论文7 2 ℃，7m i n ，延伸。

A C T l 退火温度为5 6 ℃，A L S 2 、A L S 3 退火温度为5 8 ℃P C R 产物4 ℃保存3 ．6R T - P C R 产物凝胶电泳与半定量分析( 1 ) 配制2 ％琼脂糖凝胶：称取适量琼脂糖，加入0 ．5 ×T B E 中，微波加热熔化混匀，凉至约6 0 ℃时，每1 0 0 m 1 0 ．5 ×T B E 中加入靴l 溴化乙锭，摇匀倒入胶板，室温静置2 0 m i n 以上 2 ) 取靴l 目的基因扩增产物和靴l 内参的扩增产物，与犁l6 ×L o a d i n gB u f f e r混匀后加样，凝胶放入0 ．5 ×T B E 的电泳缓冲液，8 5 V 电压，电泳1 h 3 ) 电泳结束后，紫外投射仪上观察结果并用凝胶成像系统拍照 4 ) 应用Q u a n t i t yO n e 电泳分析软件进行P C R 产物凝胶条带分析并记录结果如图2 ~ 5 所示，每个样品在电泳后均有两条带，即内对照A C T l 基因P C R 产物带和目的基因P C R 产物带，A C T l 基因m R N A 的表达水平相对稳定，可设定为1 ，然后以A C T l 基因m R N A 的表达水平为参照，检测目的基因表达水平，』钮S 2 或A L S 3相对含量强度- - A L S 2 或A L S 3 的密度／内对照A C T l 的密度，结果为相对定量值，以数字表示，用于统计分析。

4 ．统计学方法采用两样本均数配对资料的t 检验，当资料不符合正态分布时，用符号秩和检验( W i l c o x o n 配对法) ，以S P S S l l ．5 医学统计软件包对实验结果进行统计学分析，以P 9 5 ％( 见I 茎t 1 ) 白念珠菌标准株和临床株均形成成熟的生物膜结构2 ．提取R N A 的纯度提取的R N A 量经紫外分光光度计测量R N A 在2 6 0 n m 、2 8 0 n m 处的光吸收时发现，吸收峰值在2 6 0I L r n 处，经计算O D 2 6 0 ／O D 2 8 0 在1 ．8 0 至U 2 ．0 之间( 见表2 ) 表2 提取的白念珠茵标准株R N A 的纯度和质量窒鱼型墅旦里兰鱼 里兰垒 望三鱼Q 丝璺Q垦堕垒鉴鏖( 竺丝圣! Q ! )浮游状态00 ．3 2 3 _ + 0 ·0 6 00 ．1 7 3 - - + 0 - 2 81 ．8 6 4 _ + 0 ·0 5 18 ．5 4 - + 1 ·5 9生物膜状态00 ．3 1 6 - + 0 ．0 7 20 ．1 7 4 - + 0 ．4 11 ．8 3 6 - + 0 ．0 2 88 ．8 7 4 - 2 ．0 30 酵母状态芽管状态00 ．4 1 2 ±0 ．0 6 60 ．2 1 9 ±0 ．4 31 ．8 8 1 ±0 ．0 6 37 ．9 2 ±1 ．2 60 ．2 9 3 ±0 ．0 7 50 ．1 6 0 ±0 ．4 41 ．8 2 9 ±0 ．0 2 59 ．1 3 ±2 ．3 13 ．P C R 产物条带目的基因A L S 2 片段经I 汀．P C R 扩增后呈3 6 6 b p 的条带，目的基因A L S 3 片段经R T ．P C R 扩增后呈3 4 2 b p 的条带，内参照A C T l 基因片段经R T ．P C R 扩增后呈2 0 9 b p的条带，各泳道均无明显非特异条带，目的基因及内参照基因特异扩增产物带清晰( 见图2 - 5 ) 。

4 ．标准株白念珠菌酵母状态与芽管状态A L S 基因m R N A 表达的比较4 株白念珠茵标准株中，酵母状态的白念珠茵A L S 2 m R N A 表达量为2 ．4 7 5 - +0 ．8 2 6 ，芽管状态的表达量是2 7 ．2 5 0 ±6 ．2 3 8 ，两者的差异有显著统计学意义( P = o ．0 0 5 ，P < 0 ．0 1 ) ，标准株芽管状态的白念珠菌A L S 2 m R N A 的相对表达水平明显高于酵母状态；白念珠菌标准株中，酵母状态A L S 3 m R N A 表达的有1 株，总体表达量为O ．1 0 8±0 ．0 8 3 ，芽管状态的表达量为6 5 ．8 2 5 ±1 4 ．1 8 4 ，两者的差异有显著统计学意义( P- - 0 ．0 0 2 2 ，P < 0 ．0 1 ) ，标准株芽管状态的白念珠菌A L S 3 m R N A 的相对表达水平明显高于酵母状态( 见表3 ) 1 0青岛大学硕士学位论文表3 标准株白念珠菌酵母状态与芽管状态A L S 2 m R N A 和A L S 3 m R N A 的表达注：标准株白念珠菌，酵母状态与芽管状态A I ．S 2 m R N A 比较，△P < 0 ．0 1 ：酵母状态与芽管状态A L S 3 m R N A 比较，▲P < 0 ．0 1 。

5 ．临床株白念珠菌酵母状态与芽管状态A l A S 基因m R N A 表达的比较1 1 株白念珠菌临床株中，酵母状态的白念珠菌A L S 2 m R N A 表达量为2 ．5 7 0 ±0 ．7 8 0 ，芽管状态的表达量为2 6 ．5 6 0 ±6 ．0 4 6 ，两者的差异有显著统计学意义( P = 0 ．0 0 0 ，P < 0 ．0 1 ) ，临床株芽管状态的白念珠菌A L S 2 m R N A 的相对表达水平明显高于酵母状态；I 临床株中酵母状态A L S 3 m R N A 表达的有2 株，总体表达量为0 ．1 7 8 ±0 ．1 1 6 ，芽管状态的表达量为5 5 ．2 7 3 ±1 0 ．6 4 5 ，两者的差异有显著统计学意义( P = 0 ．0 0 0 ，P< O ．0 1 ) ，临床株芽管状态的白念珠菌A L S 3 m R N A 的相对表达水平明显高于酵母状态( 见表4 ) 表4 临床株白念珠菌酵母与芽管状态A I ．S 2 m R N A 和A L S 3 m R N A 的表达注：临床株白念珠菌，酵母状态与芽管状态A L S 2 m R N A 比较，△P < 0 ．0 1 ：酵母状态与芽管状态A I ．S 3 m R N A 比较，▲P < 0 ．0 1 。

6 ．标准株白念珠菌浮游状态与生物膜状态A L S 基因m R N A 表达的比较4 株白念珠菌标准株中A L S 2 m R N A 浮游状态的表达量为5 ．1 3 7 4 - 0 ．5 4 3 ，生物膜状态的表达量是9 ．8 7 5 4 - 0 ．4 3 8 ，两者间的差异有统计学意义( P = O ．0 2 7 6 ，P < 0 ．0 5 ) ，标准株白念珠菌生物膜状态的A L S 2 m R N A 的相对表达水平明显高于浮游状态；A L S 3 m R N A 浮游状态的表达量为1 0 ．0 0 0 4 - 1 ．8 4 0 ，生物膜状态的表达量为1 3 ．9 2 5 4 -结果0 ．7 8 1 ，两者问的差异有统计学意义( P = 0 ．0 4 0 5 。