弓形虫p30Rop2复合基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的构建.doc

1弓形虫 p30Rop2 复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒的构建作者：程鹏，张佃波，王海防，公茂庆 【摘要 】 目的：构建弓形虫 p30 Rop2复合基因大肠杆菌/分枝杆菌穿梭表达质粒方法：利用 PCR 技术从已构建的pET30 p30 Rop2质粒扩增 p30 Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒 pSTM3，构建重组质粒pSTM3 p30 Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析结果：成功构建 pSTM3 p30 Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框结论：pSTM3 p30 Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件 【关键词】 弓形虫;p30 Rop2 复合基因；穿梭表达载体弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界性分布的专性胞内寄生原虫，能引起人兽共患的弓形虫病全世界约有 1/3 的成年人感染弓形虫，但多为隐性感染我国人群的感染率约在5％～20 ％，平均为 8.5%孕妇感染弓形虫后，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，可导致流产、畸胎、死胎等，而在 AIDS 患者等免2疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主要病原之一［1］ 。

由于弓形虫寄生生活的复杂性、形态的多变性，仅利用某一时期、某一形态的单一抗原制备的单价疫苗，远远不能激发全方位的宿主抗寄生虫免疫反应，难以达到理想的抗虫目的 本研究将弓形虫主要表面抗原 p30 和棒状体蛋白 Rop2 候选抗原基因克隆到大肠埃希菌  分枝杆菌穿梭表达载体 pSTM3 中，构建重组pSTM3 p30 Rop2质粒，为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件1 材料和方法1.1 材料1.1.1 质粒和菌株 重组克隆质粒 pET30 p30  Rop2、穿梭表达质粒 pSTM3 和大肠杆菌 DH5α均为本单位实验室保存1.1.2 主要试剂 TaqDNA 聚合酶、dNTP、Hind III、T4DNA 连接酶,均为 Promega 公司；DNA 纯化试剂盒（QIAquick）,质粒抽提试剂盒（QIA prep Spin Miniprep kit）均为 QIAGEN 公司产品 EcoRⅤ 为 Fermentas 公司产品；TOPO克隆试剂盒为 Invitrogen 公司产品31.1.3 引物的设计与合成 根据 GenBank 提供的序列，分别设计 p30 基因的上引物和 Rop2 基因的下引物。

在上引物 5′端引入EcoRⅤ酶切位点，下引物 3′引入 HindⅢ酶切位点，并分别在 NCBI进行 BLASTEN 查看引物的特异性，并用 Oligo 软件进行评分,引物序列为：P1 5’ ACGATATCAAGGAGATATACCATGTTCACTCTCAAGTGCC 3’;P2 5’ ATAAGCTTTCATGCCGGTTCTCCATCAG 3’ ，由上海生工生物技术有限公司合成1.2 方法1.2.1 目的基因 p30 Rop2的 PCR 扩增 提取pET30 p30 Rop2质粒，作为模板，反应条件：预变性 94℃ 2 min；94 1 min；55℃ 45 s，72℃ 3 min，30 个循环；最后延伸72℃ 15 min扩增产物约为 1 900 bp，经 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定1.2.2 扩增片段的 TOPO TA克隆和测序 将 PCR 产物进行4跑胶回收后，建立 6 μl连接体系：PCR 产物 3 μl、salt solution 2 μl、TOPO vector 1 μl,16℃ 4 h,将连接产物全量转化 200 μl DH5α感受态，PCR 法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定后送公司测序。

1.2.3 穿梭表达载体 pSTM3 p30 Rop2的构建 将TOPO p30 Rop2质粒和 pSTM3 空质粒同时双酶切，回收目的基因片段和载体大片段建立如下连接体系：目的基因 6 μl、载体大片段 2 μl、T4DNA 连接酶 1 μl、Buffer 1 μl；16℃ 3 h将连接产物全量转化 200 μl DH5α感受态，PCR 法鉴定阳性重组子，并提取质粒酶切鉴定2 结果2.1 目的基因的体外扩增 p30 Rop2复合基因 PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后 ,约在 1 900 bp 处见到明显的扩增产物条带, 未见非特异扩增条带, 与理论扩增产物长度吻合(图 1)2.2 TOPO TA克隆载体的鉴定 提取 PCR 阳性菌提取质粒后用 EcoRⅤ 和 HindIII 双酶切，得到的基因片段大小与预测值一致测序结果与 GenBank 报道的序列进行比对后发现有三个碱基发生突变，其中两个不改变氨基酸的性质，Rop2 基因的 174 位氨基酸密码子由 CCT 突变为 CTT，编码氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸，见5图 22.3 重组质粒 pSTM3 p30 Rop2的酶切鉴定 提取筛选到的 pSTM3 p30 Rop2质粒，分别进行 EcoRⅤ+HindⅢ双酶切及EcoRⅤ+HindⅢ+EcoRⅠ三酶切和 PCR 扩增，双酶切可见大小约1 900 bp 和 5 000 bp 的两条带，三酶切后可产生 1 100 bp、750 bp 和 5 000 bp 三条带，大小与目的 DNA 和载体片段长度相符，PCR 扩增可获得与预期相符、大小约 1 900 bp 的单一条带，表明p30 Rop2复合基因已克隆到 pSTM3 载体中。

3 讨论p30 蛋白是弓形虫速殖子表面主要抗原，基因全长 1 634 bp，是单一拷贝基因，不含有内含子，其编码区序列（CDS）从311 1321，其中 311 541编码信号肽序列［2］ p30 在弓形虫入侵宿主细胞时起重要作用，是一种重要的疫苗侯选抗原，p30 亚单位疫苗和核酸疫苗的研究多有报道，均可以产生一定的免疫保护性［3］ ，但由于其表达具有特异性，只能在速殖子阶段表达，所以不能产生针对弓形虫各个阶段的特异性抗体Rop2 是弓形虫棒状体分泌的一种蛋白，定位于纳虫泡表面，其氨基端暴露与宿主细胞胞质侧，主要介导纳虫泡与宿主细胞线粒体和内质网接触，在弓形虫生活的各个阶段均有表达pSTM3 是大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质6粒该质粒可以在大肠杆菌和分枝杆菌中复制并可以在分枝杆菌表达外源蛋白［4］ 外源蛋白的表达受控于 Hsp 60 启动子，该启动子来源于 BCG 热休克蛋白 Hsp 60，当受到热或者应急刺激时会启动下游基因的转录，并且体外实验已证明该启动子可以在小鼠巨噬细胞内诱导目的基因的转录和表达［5］ 本研究选用 p30 基因的部分序列，去掉了 N 末端的信号肽和 C 末端的疏水性尾巴和 Rop2 部分序列，包括三个 T 细胞表位 197 216，393 410 ，501 524 ［6］ 。

经 PCR 扩增的目的基因测序后发现 Rop2 基因有一个碱基的突变改变了氨基酸的性质，但这个突变是扩增质粒模板已经存在的，且不在三个 T 细胞表位内，已有实验证明该突变不影响重组蛋白的免疫反应性本研究将截短的 p30 基因和 Rop2 基因联合重组于pSTM3 大肠杆菌 /分枝杆菌穿梭质粒，为下一步构建弓形虫分枝杆菌疫苗打下了基础参考文献】［1］ Wong SY, Remington JS. Biology of Toxoplasma gondii［J］. AIDS，1993,7(3):299 316.［2］ Burg JL, Perelman D, Kasper LH, et al. Molecular analysis of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii The Journal of Immunology,1988，141(10)：3584 3591.7［3］ Henrik VN, Sannelise L, Lone C, et al. Complete Protection against Lethal Toxoplasma gondii Infection in Mice Immunized with a Plasmid Encoding the SAG1 Gene［J ］. Infection And Immunity Dec，1999，67(12)：6358 6363.［4］ Gaora PO.Expression of genes in mycobacteria［J ］. Methods Mol Biol， 1998，101:261 273.［5］ Batoni G, Maisetta G, Florio W, et al. Analysis of the Mycobacterium bovis hsp60 promoter activity in recombinant Mycobacterium avium［J］. FEMS Microbiol Lett, December1,1998，169(1):117 124.［6］ Rafael SV, Marco AB, Christine D, et al. Epitopes Recognized by Human T Lymphocytes in the ROP2 Protein Antigen of Toxoplasma gondii［J］. Infection And Immunity,1996,64(9)：3858 3862.。