井冈霉素的发酵配方优化研究.docx

    井冈霉素的发酵配方优化研究    周海平 钱江伟摘要：以现有的井冈霉素工业生产菌种S#菌株为研究对象，在现有生产配方的基础上，调整发酵碳、氮源品种和配比，在设备、种龄、种量、空气流量等工艺条件相同的情况下，通过摇瓶和中试罐试验，根据试验实测值，探究井冈霉素工业生产的最佳碳、氮源原料与配比，实现生产配方的优化关键词：井冈霉素;种子;发酵配方;优化井冈霉素是通过吸水链霉菌井冈变种发酵产生的一种多元混和物，有效成分为井冈霉素A[1]，主要用于防治水稻、小麦纹枯病和棉花、蔬菜、豆类等农作物的立枯病以及葡萄等果树的黑粉病等，是我国迄今为止应用最早、使用最广的廉价高效农用抗生素药物，深受农户欢迎[2]近年来，井冈霉素在其他领域（如医药等）也有广泛的应用，井冈霉素的生物合成中间体是制造治疗糖尿病药物的原料之一，经济价值很高[3]为了迎合市场需求，研究生物合成井冈霉素生产配方优化，提高井冈霉素发酵水平，降低成本，提高经济效益1 试验1.1 设备与试剂S#菌株斜面种子、天门冬氨酸、大米粉（80目）、酵母粉、玉米粉、黄豆粉（60目）、花生粉（60目）、氨基酸粉（60目）、棉籽粉（60目）、蚕蛹粉（60目）、磷酸氢二钾（工业级）、氯化钠（工业级）、氢氧化钠（工业级）、消泡剂（工业级）、恒温振荡培养箱（SPH-2110）、三角瓶（500 mL）、种子罐（1000 L）、发酵罐（1000 L）、生物显微镜、酸度计、液相色谱仪。

1.2 种子配方优化1.2.1 种子试验配方以摇瓶试验方式筛选最佳种子配方[4]，以生产配方为基础，以大米为主碳源，探究玉米粉对发酵的影响，同时，探究氮源种类、配比不同的种子培养基配方对发酵水平的影响，采用正交试验，各组种子培养基按表1配制摇瓶发酵配方：米粉8.00 %，酵母粉0.50%，黄豆粉1.50%，花生粉1.50%，棉籽粉0.50%，氯化钠0.20%，磷酸氢二钾0.02% 1.2.2 试验步骤按上述配方中的原料种类和比例配制培养基，用20.00%氢氧化钠溶液将pH调至7.5，分装至500 mL三角瓶中，装量为60 mL，用棉塞加牛皮纸进行环绕式封口，立即用灭菌锅高温（120 ℃）消毒30 min，自然冷却备用在无菌条件下，将50 mL无菌水倒入S#菌株斜面种子瓶中，用竹签刮下菌落捣碎摇匀后，用无菌移液管，对种子瓶进行接种，每个种子瓶的接种量为5 mL，用8层纱布封口，放至SPH-2110恒温振荡培养箱培养，转速为240 r/min，37℃ 培养20～30 h，跟踪菌丝挂壁状态，镜检菌体生长的形态，判断种子成熟时机种子成熟后迅速接入预先准备好的无菌发酵摇瓶，接种量为5.00%，用8层纱布封口，每组2个放至 SPH-2110恒温振荡培养箱培养，转速为240 r/min，40℃培养92 h后取滤液，用液相色谱仪检测井冈霉素A组分含量。

1.3 发酵配方优化考虑摇瓶试验条件与大生产条件存在一定的差异，中试罐的发酵条件与大生产发酵罐的条件更加接近，所以将发酵配方优化试验放在中试罐上进行[5]以大生产配方为基础，探究主要碳源大米粉配比不同和氮源种类不同、配比不同对发酵水平的影响，采用正交试验，发酵培养基按表2配制1.3.1 发酵试验配方从摇瓶种子配方的试验结果中选取最佳配方作为发酵配方中试试验的种子罐配方（见表2）其他统一按氯化钠0.20%、磷酸氢二钾0.02%、消泡剂0.03%配比1.3.2 试验步骤每批投料前对种子罐、发酵罐及各个阀门进行清洁和检查，防止染菌种子罐按400 L计料、350 L定容，发酵罐按6000 L计料、5 000 L定容，先投碳、氮源， pH调到7.5，投入无机盐消泡剂，123 ℃蒸汽灭菌30 min，冷却至培养温度，每個种子罐接入1个斜面种子瓶种子罐培养条件：37 ℃恒温，通气量为1.0∶1.0，搅拌转速为240 r/min，培养时间为20～30 h，种子罐移种前要镜检，确保没有杂菌，种子生长成熟才可以移入发酵罐进行培养，移种量控制在5.00%发酵罐培养条件：40℃恒温，通气量为1.0∶1.2，搅拌转速为180 r/min，培养80 h后取滤液，用液相色谱仪检测井冈霉素A组分含量。

2 结果讨论2.1 种子培养基配方对发酵水平的影响影响发酵水平的因素除了发酵过程控制外，最重要的是种子质量的控制在种子培养过程中，中间控制环节往往相对简单，影响最大的还是培养基原料的选择种子培养基原料的选择一般首先要求原料质量稳定，既有利于菌丝的快速生长，又要保证每批种子生长稳定、产素能力高，确保移入大罐后稳产、高产按表1试验方案得到试验结果如表3所示从表3的试验数据得出，用摇瓶试验筛选最佳种子配方 A2种子配方：大米粉3.00%，花生粉2.00%，酵母粉0.50%，蚕蛹粉0.50%在相同的培养条件下，种子生长较其他配方快2～4 h，发酵效价提高3.58%～20.16%，较实际大生产配方提高3.58%，为最佳配方另外，碳源用大米粉较玉米粉生长更快，发酵效价提高13.55%;氮源用花生粉优于黄豆粉，蚕蛹粉虽然用量不大，但明显有利于提高发酵效价  2.2发酵培养基配方对效价的影响发酵培养基原料的选择不仅要考虑生产水平的高低、原料的单位消耗、能耗、原料的易得程度和加工难度，还要考虑对后道提取的影响和产品的质量，但最核心的还是综合经济效益发酵培养基配方中试优化试验在种子配方优化后得出结论，选择A2种子配方按表2的试验方案进行，试验检测结果如表4所示。

从表4的试验数据可知，在A 2种子配方条件下，发酵培养基B8配方（大米粉10.00%，花生粉1.00%，棉籽粉1.00%，黄豆粉1.00%，酵母粉0.50%，蚕蛹粉1.00%）的发酵效价最高，比其他试验配方高2.43%～12.75%，较大生产配方提高12.75%另外，碳源用大米粉从8.00%提高到10.00%，发酵效价平均提高7.75%，效果明显;在大米粉配比相同的情况下，配方中含蚕蛹粉的发酵效价较高3 结语通过对井冈霉素种子配方的摇瓶优化正交试验、发酵配方中试优化试验，筛选到的A2种子配方和B8发酵配方效价比实际大生产配方分别提高了3.58%和13.55%，如果能在大生产中推广并达到中试效果，预计至少能为企业增效500万元[Reference][1]徐利剑，赵维，曹聪，等.井冈霉素的研究进展[J].中国农学通报，2015（22）：191-198.[2]谢丽媛，尹文兵，李伟，等.白僵菌天然产物及其药理活性和生物合成研究进展[J].天然产物研究与开发，2021（1）：150-164.[3]沈寅初.井冈霉素开发研究25年[J].植物保护，1996（4）：44-45.[4]郭文灿，钟世华，黄叶菊.井冈霉素生产工艺优化研究[J].精细化工中间体，2006（2）：3.[5]王苹，吴佳文，张海波，等.我国防治小麦赤霉病的药剂种类评析[J].中国植保导刊，2021（1）：7.  -全文完-。