第十章 反刍动物营养实验技术.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑第十章 反刍动物营养实验技术 第十章 反刍动物养分测验技术 第一节 人工瘤胃技术 一. 人工瘤胃技术概述 人工瘤胃技术是体外研究瘤胃微生物养分与代谢的一类技术方法，又称瘤胃模拟培养法由于人工瘤胃技术不受试验动物的限制，可以在常规测验室条件下举行研究，因此得到了越来越广泛的应用 早期的人工瘤胃技术主要应用于较简朴的研究目的如Woodman和Evans(1938)，通过体外瘤胃发酵表明纤维素在瘤胃内降解的唯一中间产物是葡萄糖，终产物是VFA和乳酸Quin（1943）用体外法研究了不同碳水化合物瘤胃发酵的产气量Pearson和Smith（1943）用体外法研究了瘤胃微生物对尿素的利用等McDougall（1948）关于绵羊唾液矿物质组成的研究在人工瘤胃技术进展史上具有重要意义，之后的各种人工瘤胃系统人工唾液的配制均参照了McDougall的研究结果早期的人工瘤胃发酵装置对比简朴，不少装置仅是在厌氧的条件下对瘤胃液举行简朴的培养由于发酵产物在系统内的不断积累，这类系统不能用于要求长时间发酵的研究工作，通常有效的发酵时间为12～24小时。

Louw于1949年设计了一套带有透析系统的人工瘤胃装置，将瘤胃液和底物放入渗析袋或半透膜中，然后悬浮在缓冲液内该装置在确定程度上将底物和发酵终产物分开开，延长了有效发酵时间 二十世纪五十年头至六十年头，人工瘤胃技术在牧草有机物和纤维素瘤胃降解研究方面得到了大量应用用人工瘤胃技术研究的内容包括不同牧草以及牧草与纯纤维体外降解速度对比；牧草颗粒大小对体外降解速度的影响；体外评定牧草养分价值；用体外牧草发酵测定结果预料体内发酵等这一阶段的人工瘤胃装置也趋于繁杂，以更加接近瘤胃发酵的真实处境如Donfer使用的发酵装置由32个发酵瓶组成，每个发酵瓶的容积为90ml，装入的发酵液容量为50ml每个瓶均有进气口和出气口，以每分钟160个气泡的速度向瓶内通入二氧化碳 二十世纪七十年头，随着反刍动物蛋白质养分研究的深入，人工瘤胃技术开头应用于饲料蛋白质的瘤胃降解率评定1972年，Ben Braver察觉体外培养法中的氨浓度与瘤胃内氨浓度有很好的相关，并用短期培养法对饲料蛋白质的瘤胃降解率进 行了评定Monhadeva（1979）、Broderik（1978，1979）用短期培养法评定了饲料蛋白质的瘤胃降解率和微生物蛋白的产量。

Road（1983）根据瘤胃产气量与氨利用量之间的关系，用能量、微生物蛋白合成量计算了饲料蛋白质的降解率我国的吴毓群（1988），任鹏（1989）等分别用短期发酵法和持续发酵法测定了饲料蛋白质与干物质的降解率 二十世纪八十年头后期，人工瘤胃技术的应用范围扩展到研究养分物质对瘤胃微生物合成量的影响及养分物质的匹配关系这方面的研究因难以操纵瘤胃内环境而不能在体内举行，例如举行瘤胃NH3浓度与瘤胃微生物合成量关系的研究由于瘤胃和动物本身对NH3浓度有调理作用，这样就不能根据不同NPN在瘤胃内NH3浓度的差异和消散速度判断NPN的优劣人工瘤胃技术由于轻易实现试验条件的操纵而具有体内法不成对比的优越性这一时期人工瘤胃装置以可控性持续动态发酵的模拟装置为主，中国农业大学自行研制的RSⅠ—Ⅱ型瘤胃持续动态模拟装置即属此类型 二. 短期人工瘤胃发酵装置测定瘤胃产气量 短期人工瘤胃发酵装置可以根据研究目的举行不同的设计，其共同特点是静态发酵，不对底物和产物举行分开，因而只能持续较短的时间但试验装置简朴，在饲料养分价值评定等研究方面仍具有很大的价值下面介绍英国Rowett研究所用于测定瘤胃微生物产气量的人工瘤胃技术，其主要用途是研究不同粗饲料及添加剂等对饲料瘤胃降解及甲烷气能损失的影响。

人工唾液的制备：人工唾液由蒸馏水、矿物质元素溶液、微量元素溶液、刃天青（reazurin）溶液混合而成将混合溶液置于三角瓶中，水浴加热至39℃之后参与恢复液将以上混合溶液置于39℃磁力搅拌器上不断搅拌，同时通入CO2气泡，直至溶液颜色由蓝变至粉红结果变为无色通明，说明人工唾液已呈恢复状态升高CO2通气管至液面以上，并连续通入CO2，调整PH值至7.0～7.30 矿物质溶液: Na2HPO4 5.7g KH2PO4 6.2g MgSO4 0.6g 加蒸馏水至1升 微量元素溶液: CaCl2·2H2O 16.12g MnCl2·4H2O 10.0g CoCl2·6H2O 1.0g FeCl2·6H2O 0.8g 加蒸馏水至1升 缓冲溶液（PH7.0～7.3）: NaHCO3 35g （NH4）HCO3 4g 加蒸馏水至1升 刃天青溶液: 100mg/100ml 人工唾液: 蒸馏水 矿物质溶液 缓冲液 微量元素溶液 刃天青 恢复溶液 蒸馏水 1MNaOH Na2S9·H2O(mg) 23.8 1.0 168 47.5 2.0 336 71.3 3.0 504 95.0 4.0 672 500 23.75 120.0 120.0 0.06 0.61 最终容积（ml） 1000 475 240.0 240.0 0.12 1.22 1500 712.5 360.0 360.0 0.18 1.83 2000 950.0 480.0 480.0 0.24 2.44 瘤胃液制备：抽取瘤胃液（一般从2-3只试验动物抽取并混合，经三层纱布过滤）。

将瘤胃滤液参与到人工唾液中，人工唾液与瘤胃滤液的体积比例为2:1 发酵管的制备：发酵管可以选用50～100ml的玻璃注射器，上有刻度称取200mg待测样品参与每一个发酵管中，并切实记录参与的待测样品重量抽入30ml瘤胃液，排出空气后用橡皮帽封口置入39℃水溶摇床上发酵空白对照管仅参与瘤胃液，不加待测样品，以校正产气管对于化学物质等对产气量的影响研究还应参与不含化学物质而仅含待测样品和瘤胃液的对照对粗饲料，读产气量数据的时间为3，6，12，24，48，72小时；对于精饲料，24小时内的读数次数应适当增加开头发酵的前24小时内应轻轻混匀发酵管内容物2-3次 三. 持续动态人工瘤胃发酵系统 持续动态人工瘤胃发酵系统的布局较为繁杂，可以应用于常规饲料养分价值评定、蛋白质饲料瘤胃养护技术、各种化学试剂和药物对微生物代谢影响及瘤胃养分调控等方面的研究由于应用持续动态人工瘤胃系统举行的研究通常要求持续发酵的时间为2-10天，因此需要对整个系统的技术条件有一个严格的要求，以接近瘤胃发酵的真实处境 ⒈ 持续动态人工瘤胃发酵系统的技术指标 1.1 瘤胃液与人工唾液的比例： 以1:1较为梦想，随着人工唾液比例的增加，发酵液的PH增大，NH3浓度下降。

1.2 外流速度： 早期的持续动态人工瘤胃装置固相和液相的外流速度一致，后来熟悉到这与瘤胃内容物的排空处境不一致Hoover等（1991）在总结相关研究工作的根基上提出，持续动态人工瘤胃装置的液相外流速度以0.12%/h、固相外流速度以0.042%/h为好在实际应用过程中最好根据研究目的，通过试验确定 1.3 温度： 对系统的发酵温度操纵确定要切实，即使0.5℃的差异也会对结果产生明显的影响由于瘤胃微生物对高温更加敏感，应更加留神发酵温度不超过40℃，即使在40℃下经过较长时间，也可查看到活性下降适合的发酵温度为39℃ 1.4 PH值： 发酵液的最正确PH值在6.7至7.0之间以淀粉或糖类为发酵底物时，轻易导致发酵液的PH值下降一般在发酵初期每小时调理一次PH值，可用碳酸氢钠调理至6.9以尿素为底物时易导致发酵液PH值的上升，由于瘤胃微生物对于高PH值更为敏感，因此应实时调理，可用磷酸调理至6.9 ⒉ 瘤胃微生物来源和接种方法： 用于提取瘤胃微生物的动物，其日粮应根据研究目的而定如以淀粉的瘤胃降解为研究目的，动物的日粮中应含有较高比例的淀粉瘤胃微生物可以从瘤胃液制备，也可以从瘤胃内容物制备。

从瘤胃液制备时，用硬质塑料管从瘤胃的不同部位吸取瘤胃液，过滤后备用从瘤胃内容物制备时，取瘤胃内容物置入盛有生理盐水的塑料袋中，用力拍打后过滤，滤液备用如以获得微生物的最大活力为目的，可 将瘤胃液直接参与系统中；如研究目的为测定微生物的养分需要量，那么应向系统中参与提取的瘤胃微生物 ⒊ 维持厌氧状态： 发酵系统应有良好的气密性，以防止空气进入发酵开头前向系统中通入CO2 和N2的混合气体（CO2 95%+N2 5%），以摈弃原有空气发酵过程中的厌氧状态可以通过不断通入CO2（40m2/min）来维持，气密性良好的处境下也稳当发酵过程中产生的CO2来维持 ⒋ 搅拌： 在持续发酵装置中可以通入的CO2起到搅拌的作用，也可由电机（6-7转/分）或磁力搅拌器举行搅拌发酵系统的搅拌不易太强烈，有研究说明强烈搅拌对纤维素的降解有不利影响 ⒌ 氧化恢复电位（Eh）： 在厌氧环境中，不断积累的恢复性物质使发酵系统的恢复性不断巩固在瘤胃内通过产生烷摈弃多余的电子对，将瘤胃液的Eh维持在-350-500μV之间对于持续发酵的人工瘤胃系统可以通过参与恢复剂调理Eh，常用的恢复剂有硫化铜、维生素C及半胱氨酸和胱氨酸等。

四. 持续动态人工瘤胃发酵系统RSⅠ—Ⅱ RSⅠ—Ⅱ是中国农业大学动物科技学院冯仰廉主持研制的持续动态系统该系统吸收了短期发酵装置和尼龙袋为固相的长期发酵装置（Rusitec）的优点，举行试验研究的重复性好，不同试验周期和不同发酵罐间测定结果的变异系数一般小于5%该系统在模拟瘤胃内环境方面做到了非均一性，即在让饲料与发酵测定混合的同时，可以模拟瘤胃内饲料自然分层的现象发酵罐的喂料量和喂料次数可人为调理，持续发酵间长达10天以上，能模拟真实瘤胃内固相和液相外流速度的不同状况，试验期间可收集发酵产生的气体 ⒈ RSⅠ—Ⅱ的设计与组成 10-1是Ⅰ—Ⅱ的正面图，装置放在长×宽×高为180cm×120cm×60cm的操作台上装置的支架为长方体框架，长×宽×高为140cm×40cm×90cm，用3cm的三角铁焊成框架上面是一块厚3cm的木板，上面安装有电机、减速器及连杆、温度操纵仪 — 8 —。