常用DNA酶的总结.doc

1 T4DNA连接酶:本酶催化相邻DNA链的5’—P末端和3’—OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程,将目的基因连在质粒载体上,作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键）,需ATP作辅酶本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接. T4DNA连接酶可连接DNA—DNA，DNA—RNA,RNA—RNA和双链DNA粘性末端或平头末端.无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'—磷酸末端和3'-羟基末端间的连接还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口以上反应均需消耗ATP.粘末端的连接反应： 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2—6之间最好，低于2：1就会导致较低的连接效率，高于6：1则会导致多个插入摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算.平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢（其Km值约为突出末端的100倍).进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。

与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1：1,同时增大DNA浓度以便取得良好效果 (0.05-0.1 μg／ul以上）.反应温度：该酶的最适温度为37℃,由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行.若反应1-2小时左右的话也可在室温下进行反应抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg 2+,因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换.2. T4 DNA聚合酶: T4DNAPolymerase,即T4DNA聚合酶,是一种模板依赖的DNA聚合酶,可以依赖于DNA模板对5' 端突出末端进行补平；同时可对3’ 端突出末端进行削平也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应　　特点:T4DNAPolymerase由于同时具有5'→3' DNA聚合酶活性和3’→5’ DNA外切酶活性(但不具有5'→3’外切酶活性），可以用于将5’端突出末端补平、3’端突出末端削平T4DNAPolymerase的3'→5’ 外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。

用途:T4DNAPolymerase可用于催化以下反应：DNA5’ 或3' 突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆　　活性定义:37℃ 30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs）掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位反应方法：例如，酶切完成后,没有进行任何处理，直接加入一点T4 DNA聚合酶、dNTP和BSA,37°C 10min　　失活或抑制：70℃加热10分钟可使T4 DNAPolymerase失活金属离子螯合剂可以抑制T4DNAPolymerase的活性.一般的Klenow Fragment和T4 DNA Polymerase都有5”-3"聚合酶活性和3"—5”外切酶活性，因此都可以用于补平和削平.所不同的是，T4 DNA Polymerase的活性更强 Klenow Fragment：又称Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I（E.coliDNA polymerase I)的大片断(Large Fragment)Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5'→3’聚合酶活性和3'→5’外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。

特点：对5' 突出或3’ 突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接用途：双链DNA 5’ 端突出(5’overhang）末端的补平（fill—in）;双链DNA 3’ 端突出(3'overhang）的削平;5’突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序;cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成. 来源:由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段Fermentas公司的Klenow Fragment有2种一种是DNA Polymerase I Large Fragment (Klenow Fragment）,该酶用于补平的时候不会在补平后再多加碱基.另一种是DNA Polymerase I Large Fragment, Exonuclease Minus［Klenow Fragment exo—]，此酶没有3”—5"外切酶活性，因此不能用于削平;而且，此酶在补平的时候会在补平后再加一个或更多碱基,所以不太适合用于补平 T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK)：T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK,该酶能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5’—羟基末端以及3’-单磷酸核苷间进行转移和交换：5’—OH +NTP〈=>5’—P+NDP.该酶还具有3'磷酸酶活性，将3’—磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3'-单磷酸核苷和脱氧3’-二磷酸核苷上水解掉。

用途:引物或PCR产物的5’末端磷酸化以便进行连接反应合成DNA接头（Linker） 的5’末端磷酸化以便进行连接反应DNA及RNA 5’末端的标记，用作寡核苷酸探针.5. DNA聚合酶1：1能催化单个脱氧核糖核苷酸连接到DNA链的3'端能沿5’端到3’端方向外切DNA（切除引物）3能沿3’端到5'端方向外切DNA（纠错，或者说DNA损伤的恢复）6. DNA聚合酶2：1发挥作用需要镁离子和铵根离子存在2同样能参与DNA聚合酶1参与的反应，但聚合活性低3.能沿3’端到5’端方向外切DNA7. DNA聚合酶3：1主要负责DNA链的延伸2能沿3'端到5'端方向外切DNA在DNA的复制中,DNA聚合酶3负责合成冈崎片段,而DNA聚合酶1负责将RNA引物按逐个核糖核苷酸切除并替换成对应的脱氧核糖核苷酸，最后由DNA连接酶把各冈崎片段连接起来，复制完成.活性(37度时每个酶分子每分钟聚合的核苷酸数)：DNA聚合酶1为600,DNA聚合酶2为30，DNA聚合酶3为90008. DNA水解酶与DNA限制性内切酶的区别概述DNA水解酶：催化DNA水解的一种酶，在DNA水解酶作用下，DNA被水解为一个一个的脱氧核苷酸。

任何能水解DNA的酶的统称，见到二酯键就切限制性内切酶:能切割DNA分子内部的可识别序列的磷酸二酯键，见到识别序列的两侧的磷酸二酯键就切 DNA聚合酶和DNA连接酶的区别?DNA连接酶：是一种将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶.常用于基因工程,将目的基因连在载体（一般为质粒）上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键.DNA聚合酶：以已有的核酸序列作为模板,将4种脱氧核苷酸（A、T、G、C）按照模板的碱基排列顺序,以“碱基互补原则”依次连接，聚合成为一条新的DNA链相同点都是连接的磷酸二酯键.10. DNA水解酶在哪里有作用,作用是水解DNA双链吗？DNA水解酶的作用位点在于磷酸二酯键；DNA在水解酶的作用下,可以得到四种不同的核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸【A】，鸟嘌呤脱氧核苷酸【G】，胞嘧啶脱氧核苷酸【C】，胸腺嘧啶脱氧核苷酸【T】DNA在水解酶破坏了氢键和磷酸二酯键，DNA初步水解可以得到脱氧核苷酸DNA分子彻底水解的产物是磷酸 脱氧核糖和A C G U 四种碱基，这就就需要另外一种酶了。