美洲大蠊、斑蝥提取物对3株人肿瘤细胞增殖抑制作用的研究.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑美洲大蠊、斑蝥提取物对3株人肿瘤细胞增殖抑制作用的研究 报告?提及未来20年每年新发癌症病例将达成2200万，同期癌症死亡数将上升至1300万例[1]据全国肿瘤登记中心报道，2022年中国有4292万例癌症新发病例，2814万例死亡病例，其中肺癌、胃癌、食管癌和肝癌居于前列[2]目前国内对肿瘤的治疗方式主要是手术、药物及放射治疗等癌症中、晚期，化疗和放疗为主要的治疗手段，但化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，往往伴随着严重的毒副作用，对正常细胞也有确定影响，使患者承受着身体和精神上的巨大痛楚[3] 动物源类中药资源丰富，在我国疾病治疗中的应用有着悠久的历史近年研究察觉多种药用动物中提取的活性成分在体外或体内对肿瘤细胞、荷瘤小鼠肿瘤具有确定的抑制作用[4-6]，且副作用小、相对安好，提示自然动物源抗癌药物具有较好的开发前景药用斑蝥多为芫菁科昆虫南方大斑蝥〔Mylabris phalerata Pallas〕或黄黑小斑蝥 〔Mylabris cichorii Linnaeus〕的枯燥体，临床研究说明，斑蝥提取物在治疗尖锐湿疣、斑秃、风湿、肝炎等疑难杂症时效果明显，近年来药理学测验显示斑蝥素及其衍生物对喉癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等肿瘤细胞有显著疗效[7-9]。

美洲大蠊〔Periplaneta americana〕，俗称“蟑螂〞，属昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属，现代药理学及临床研究显示其具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗衰弱、促进创面愈合、巩固肌体免疫力等作用[10-12]，大理大学药化学院工致力于药用昆虫研发近30年，何正春等[13-15]将美洲大蠊醇提取物通过聚酰胺柱层析分开划段得到不同部位，采用MTT法检测所得部位对肿瘤细胞的增殖毒性，结果说明美洲大蠊提取物对多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制活性且毒副作用较小，这些研究为开发低毒、高效的动物类抗肿瘤药物打下确定根基 基于团队前期的研究根基，笔者对大量昆虫来源的提取物举行了细胞毒活性筛选，对于活性明显的样品，再次举行复筛及量效、时效考察现将来源于美洲大蠊及斑蝥的3个活性样品对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、和人肝癌细胞HepG2的生長抑制活性及其量效、时效关系报道如下 1材料与仪器 11受试样品美洲大蠊提取物活性部位〔YS-I〕、斑蝥提取物活性部位〔YS-II、YS-III〕由大理大学昆虫生物医药研究院制备供给其中YS-I由美洲大蠊乙醇提取物经聚酰胺柱分开，40%乙醇/水片面浓缩、冷冻枯燥获得[16]；YS-II为枯燥斑蝥虫体粉末用等极性溶剂提取浓缩物，YS-III为枯燥斑蝥虫体粉末用低极性溶剂提取浓缩物；概括制备方法因涉保密内容暂不公开。

12试剂RPMI-1640培养液〔Gibco〕；DMEM培养液〔Gibco〕；胎牛血清〔Gibco〕；025 %胰蛋白酶-EDTA消化液〔密理博公司〕；噻唑蓝〔MTT〕及二甲基亚砜〔DMSO〕均购于美国Sigma公司；青霉素、硫酸链霉素〔Amersco，美国〕；顺铂〔DDP，齐鲁制药有限公司〕 13主要仪器SW-CJ-1FD型清白工作台〔苏州安泰空气技术有限公司〕；3111型水套式CO2培养箱〔Thermo，美国〕；CKX41SF型倒置相差显微镜〔Olympus，日本〕；SN255939型酶标仪〔BIO-TEK，美国〕；XK96-3微量振荡器〔江苏新康医疗器械有限公司〕；BSA124S型电子分析天平〔赛多利斯科学仪器有限公司〕；YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌器〔上海东亚压力容器制造有限公司〕 14细胞株人胃癌细胞株〔MGC-803〕、人食管癌细胞株〔Eca-109〕、人肝癌细胞株〔HepG2〕均购自中国科学院昆明细胞库 2方法 21测验原理MTT法是一种快速、简便的体外抗肿瘤药物敏感性测试方法，目前已被广泛用于抗肿瘤药物体外活性筛选测验它是利用活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶可将黄色的3-〔4，5-二甲基噻唑-2〕-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-〔4，5-dimethyl-2-thiazolyl〕-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide ]〔噻唑蓝，MTT〕恢复为蓝紫色的甲臜〔Formazan〕，甲臜不溶于水，可溶于二甲基亚砜〔Dimethyl sulfoxide，DMSO〕，通过酶标仪测定其在570nm处的光密度〔Optical Delnsity，OD〕值可揣测活细胞数目，了解受试样品对细胞增殖的作用效果。

22受试样品溶液及阳性对照品溶液的配制样品溶液配制：称取确定量活性样品冻干粉或浸膏，用少量DMSO溶解配制成100mg/mL的储蓄液，于4℃冰箱保存测验时用DMEM或RPMI-1640培养液将浓度分别稀释为300、100、50、30、10、3μg/mL阳性对照品溶液配制：称取确定量DDP冻干粉，配制成10mg/mL的储蓄液，于4℃冰箱保存测验时用DMEM或RPMI-1640培养液将浓度分别稀释为5、05、005μg/mL 23细胞培养HepG2细胞株在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养细胞形态为上皮样，贴壁生长，约每2～3日传代1次MGC-803、Eca-109细胞株均在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养细胞形态为上皮样，贴壁生长，约每2～4天传代1次 24细胞毒性测试测验取对数生长期的HepG2、MGC-803、Eca-109细胞，制成细胞密度为1×105/mL的悬液，接种于96孔板，每孔100μL，于37℃、5%CO2 的培养箱中培养24h。

细胞贴壁后，弃原培养基，每个测验孔分别参与受试样品溶液100μL，每个浓度设置3个复孔，同时设置阳性对照〔DDP〕、阴性对照〔等量不含药物的培养液〕和空白对照〔只有等量培养基、没有细胞〕，以上于37℃、5%CO2培养箱中分别持续培养24h、48h、72h后，弃去上清液，每孔参与20μL，5mg/mL的MTT溶液，37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，然后每孔参与150μL的DMSO，于微量振荡器上振荡至甲臜完全溶解，在酶标仪上于570nm波优点测定各孔的OD值 25统计学处理按以下公式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率〔%〕：细胞增殖抑制率〔%〕=〔OD阴性— OD样品〕/〔OD阴性 — OD空白〕×100%；以药物浓度的对数值为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标绘制量效曲线，并分别用SPSS170的Logistic回归模型计算不同作用时间后的半数抑制浓度〔IC50〕 3结果 31样品对所选肿瘤细胞的增殖影响效果3个活性样品YS-I、YS-II、YS-III及阳性药DDP对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2的IC50值，详见表1 32样品对所选细胞增殖抑制作用的时效、量效关系分析3个活性样品YS-I、YS-II、YS-III及阳性药DDP对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2增殖抑制作用的时效、量效关系分析结果见图1、2、3。

测验结果提示3个昆虫类活性样品YS-I、YS-II、YS-III对人胃癌细胞株MGC-803、人食管癌细胞株Eca-109、人肝癌细胞株HepG2的增殖均具有确定的抑制作用；通过量效和时效关系分析说明，3个样品对所选三株细胞的增殖抑制存在确定的剂量和时间凭借关系其中YS-I对MGC-803细胞株在处理24h、48h、72h的IC50值分别为1007、973、647μg/mL，已接近阳性药DDP IC50值的1/2至1/3，具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用；对另两株细胞株Eca-109和HepG2，作用72小时后的IC50值也小于20μg/mL，提示YS-I对三株人肿瘤细胞、尤其是胃癌细胞的增殖具有明显抑制作用 4议论 蒋永新等[17]研究说明“康复新液〞〔主要成分为美洲大蠊提取物〕有抑制MGC-823肿瘤细胞生长、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡等作用，梁刚等[18]研究说明美洲大蠊提取物有抑制人肝癌细胞Bel- 7402裸鼠移植瘤生长、下调血管内皮生长因子〔VEGF〕的作用YS-I是美洲大蠊聚酰胺有效部位，对人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株HepG2的增殖均具有较好抑制作用，而人胃癌细胞株MGC-803、人肝癌细胞株HepG2分别与MGC-823、Bel- 7402细胞株为同源细胞，揣测YS-I抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、下调血管内皮生长因子〔VEGF〕相关。

YS-I尚为多成分混合物，故从其中纯化出具有研究和开发前景的高效抗肿瘤成分值得引起重视YS-II、YS-III均为斑蝥的有机溶剂提取部位，在配制样品溶液时，会有少量样品析出，这可能会对斑蝥素抑制肿瘤细胞的效果有确定影响本研究显示，昆虫来源提取物对人肿瘤细胞切实存在明显的抑制〔或杀灭〕作用，具有对其举行深入研究的科研及临床应用价值 — 7 —。