2010-3病毒遗传分析.ppt

第3章 病毒遗传分析,总论 第一节 T4噬菌体 第二节 λ噬菌体 第三节 反转录病毒,病毒的基因组结构,总 论,病毒的复制过程,T4 噬菌体对E.coli的侵染,病毒复制的模板链,第一节 T4噬菌体,,T4噬菌体的DNA是线性排列的，可是它的连锁图却是环状的 1、末端冗余:染色体的末端是相同的，即它们是冗余的（如abcdefg……wxyzabc）2、环状排列:每个染色体的末端是不同的如一个染色体可能是abcdefg……wxyzabc，而另一个染色体的顺序可能是defghi……xyzabcdef等末端冗余ab的亲本病毒是怎样产生cd、de、ef等末端冗余的子代的呢？DNA复制和子代DNA分子包装到T2和T4噬菌体头部的特殊方式所决定的在感染初期，线状的亲代DNA分子经过几轮DNA复制产生单位长度再加末端重复的子代分子，接着子代分子的重复末端之间重组，形成了很长的T2或T4基因组多连体(conca temers)，即串连重复顺序，它们自身再进行复制而重组形成更长的多连体；,感染后期，子代噬菌体的头部蛋白将这些多连体DNA分子包装起来，直到完全装满为止，每个噬菌体颗粒能包装多长的DNA分子取决于壳体本身，通常填滿头部所需的DNA超过从a到z的一套基因组，对在z后面的基因仍有空间可以包装，于是又继续包装基因a、b、c，至头部被装满时将DNA切断，由此可以看到这个病毒粒子是基因a、b、c冗余的，下一个病毒粒子将接从d起始的DNA分子开始包装至c，然后继续到d、e、f，这个病毒是d、e、f冗余的，再下一个病毒粒子从g开始包装，冗余g、h、i基因等等。

这种头部满装机制(headful mechanism)的特殊DNA包装方式就解释了噬菌体颗粒中基因的末端冗余和基因次序的环状排列：所有的子代病毒都携带有冗余DNA分子，及这种分子是不同基因冗余的证据一,证据二,有关噬菌体感染的研究方法,1、噬菌斑(plague) 噬菌体感染宿主细菌以后在含受体菌的涂布平板上形成的肉眼可见的透明圈 （大小，形状，透明度和边缘）,双层平板法分离细菌病毒（噬菌体）的技术（噬菌斑）,用单层细胞进行 培养感染噬菌体,2、一步生长曲线的实验(one-step-growth experiment) 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线该曲线可以用来确定噬菌体的潜伏期、裂解期和裂解量病毒复制的一步生长曲线,3、单菌释放实验(single burst experiment) 用来定量描述单个细菌释放噬菌体的数量,４、重组测验(recombination test) 噬菌体突变型,,,,E.coli B,５、互补测验(complementary test),,两个突变株互相满足在寄主K中进行复制所缺少的因素,从而都能复制,并在复制过程中发生基因重组。

６、缺失作图(deletion map),缺失定位是一种简便有效的定位方法 利用一系列缺失突变型(已知)作为工具，把所要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别进行重组测验，凡是能和某一缺失突变型进行重组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡是不能重组的，它的位置一定在缺失范围内，根据与一系列的缺失突变型进行重组的结果，可以精确地确定某待测突变型的位置第二节 λ噬菌体,一、 噬菌体基因组与原噬菌体,(一) 噬菌体的基因组：由48500bp构成基因分类 7个（必需基因：相邻）head11个（必需基因：相邻）tail噬菌斑形成必需的基因 复制所需基因：O、P裂解、释放所需基因：S、R 基因 正调控基因：N、Q附着区：att；专一性重组所必需：int、xis噬菌斑形成非必需基因 溶源化所需：CI、CII、CIII重组所必需：exo、red,,,,Lambda噬菌体的遗传图谱,λ噬菌体基因组的结构 粘性末端寄主细胞内环化COS位点,3',5',12个核苷酸,12个核苷酸,环化状态下,λ噬菌体DNA分子的长度为48,502碱基对,例如，头部、尾部、复制及重组四大功能的基因，各自聚集成四个特殊的基因簇。

二)、 原噬菌体与合子诱导1、原噬菌体：2、合子诱导： Hfr(λ) F-→受体菌裂解(λ进入F-)Hfr(λ)[F因子整合、λ原噬菌体]，F-[无F],,b+,原点,λ,d+ c+,a+,3、λ整合部位的确定,(三)、原噬菌体的插入与切除,1、噬菌体的插入与原噬菌体正常切除 2、原噬菌体的异常切除（1）转导噬菌体：带有细菌基因的噬菌体（2）d 转导噬菌体的特点——局限性转导 3、dgal(左臂缺失),,位点特异性重组,E.coli attB 位于 bio基因和 gal基因之间 B-GCTTTTTTATACTAA-B’ -11 +11λattP P-GCTTTTTTATACTAA-P’ -152 +82,-GCTTTTTTATACTAA- -CGAAAAATATGATT-,,,-GCTTT TTTATACTAA- -CGAAAAATATG ATT-,-GCTTT TTTATACTAA- -CGAAAAATATG ATT-,B,B’,P,P’,,,,,BOB’,POP’,BOP’,POB’,整合态,二、λ噬菌体DNA的复制,λ噬菌体DNA以两种状态存在 １、是在成熟的噬菌体颗粒中包装的DNA，呈线状，具有感染性 ２、是感染宿主细胞后立即环化，成为营养体状态,,,,,O蛋白以二聚体形式结合在4个oriC重复序列上此区域 使DNA环化,,B,P结合进环状结构,,,B,,,,J,K,E使P释放,B作为解旋酶开始解开双链,,SSB蛋白结合在单链DNA上,引物酶G组装到DNA上,合成RNA引物指导DNA的复制,λ滚环复制的晚期,四、基因的转录与调控,前早期转录,主要启动子及转录终止位点,1-前早期转录;2-后早期转录;3-晚期转录,3,,,后早期转录,A,B,,,PR nutR,tR1,,mRNA,,,,PR nutR,tR1,,mRNA,N,,,PR,tR1,,N,,没有N,有N,晚期转录,S和R为溶菌基因,五、λ噬菌体溶源途径与裂解途径的调节,λ噬菌体的Cro蛋白和CI阻遏蛋白相互拮抗： Cro蛋白阻止cI 转录，从而阻止建立溶源性； CI阻遏蛋白阻止早期基因转录，因此关闭Cro蛋白的合成。

CI阻遏蛋白在右操纵基因的排列 关闭PR和PL,促进RNA聚合酶结合PRM启动子,激活自身转录,RNA聚合酶,,表示CI二聚体,进入溶源途径:,lambda DNA 整和到宿主染色体,表示CRO二聚体,进入裂解途径:,λ噬菌体的诱导和从宿主染色体DNA上的切离,PL和PR分别负责启动子向左和向右的转录；PRE和PRM是转录cI基因的两个启动子， PRE主管建立溶源， PRM主管维持溶源；PI启动转录int基因；P’R负责晚期基因的转录PL和PR起始早期转录 产生出编码N蛋白和Cro蛋白的mRNA,CII蛋白促使PRM转录CI阻遏蛋白,N蛋白的抗终止作用进一步转录Q,Cro,CII,CIII的mRNA,Cro与OR3的结合,阻止了CI与OR2的结合,抑制了CI从PRM的转录,Cro与OL和OR结合,抑制早期基因从PL和PR转录,同时Q蛋白激活晚期基因的转录,λ噬菌体赖以发展作为基因克隆载体: 非必要基因由外源基因取代所形成的重组噬菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞一道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体DNA上，成为后者的一个组成部分第三节 反转录病毒,一、反转录病毒的粒结构 二、反转录病毒的生活周期 三、反转录病毒的基因组 四、反转录过程中DNA双链的合成和LTR的产生 五、病毒线性DNA整合到寄主细胞基因组 六、原病毒的基因表达,一、反转录病毒的毒粒结构,反转录病毒的基因组,反转录病毒RNA基因组是由两条相同的正链RNA在5’端附近通过氢键连接而形成的双体结构，因此反转录病毒具有二倍体基因组。

反转录病毒基因组RNA的长度为5-8kb5’端有帽子结构，3’端polyA，游离的RNA多数tRNA少数为rRNA,gag编码病毒粒子基质蛋白、衣壳蛋白、核酸结合蛋白 pol编码反转录酶、整合酶和蛋白酶 env编码病毒外膜蛋白,RNA基因组的中部带有gag，pol与env三个“基因”，“基因”这一术语在这里表示为编码区，每一编码区通过加工实际上产生出多种蛋白质R ：10-80bp正向重复序列 U5：50-100碱基 U3：170-1250碱基 PBS：tRNA引物结合位点,反转录病毒的生活周期,PBS,PBS,R U5,PBS U3 R,,,,PBS,R U5,,PBS U3,5’,3’,5’,5’,5’,5’,5’,5’,5’,,,,,,,,,反转录过程中DNA双链的合成和LTR的产生,,,,,,,,U3 R U5 PBS,R U5,PBS U3,U3 R U5 PBS,,,,,U3 R U5,U3 R U5 PBS,,,,,PBS U3,U3 R U5 PBS,PBS U3 R U5,5’,5’,5’,5’,5’,5’,5’,5’,,,,,病毒线性DNA整合到寄主细胞基因组,在细胞质中合成线性的原病毒DNA以后，DNA进入细胞核。

在细胞核内，除了线性DNA，病毒DNA还以环状形式存在 体外实验证明，线性DNA可以整合到染色体基因组上，此过程可以被单一病毒产物整合酶所催化病毒DNA的末端是很重要的，正如转座子一样，在末端的突变会阻止整合原病毒的基因表达,1、病毒基因的转录 原病毒DNA的转录就像大部分其他真核细胞的转录一样，也需要启动子和增强子 2、转录后加工 原病毒DNA转录合成的初转录本是从同一帽子位点起始的，因此所有的反转录病毒RNA基因组和大多数mRNA都有相同的5’端，并且在5’端形成帽子结构(m7GpppGmp) 3、病毒mRNA的翻译 全长的mRNA转运到细胞质后被翻译时，所得产物为Gag和Pol多聚蛋白当翻译开始于起始密码子而终止于第一个终止密码子时所得产物为Gag蛋白如果要表达Pol蛋白，则必须要越过此终止密码子反转录病毒的翻译（一）,病毒外壳蛋白,蛋白酶,反转录酶 整和酶,反转录病毒的翻译过程（二）,,外膜糖蛋白,第3章 复习思考题 1.简述λ噬菌体的裂解周期，溶源周期及二者之间的关系 2.简述λ噬菌体基因组的基本结构及一些重要基因的功能 3.简述λ噬菌体的转录与调控 4.试述CI蛋白的结构和功能。

5.为什么紫外线照射可以诱导溶源化的λ噬菌体裂解？ 6.Cro蛋白的结构和功能是什么？ 7.λ噬菌体左向转录已转录了int基因，为什么int基因本身还需要有自己的启动子？ 8 .如果用T4噬菌体染色体进行变性和复性将会产生什么样的结构？如果用λ又会怎样？ 9.LTR的产生过程。