实验三枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析.ppt

枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的盐析与分析盐析与分析盐析与分析盐析与分析 2008.12.052008.12.05实验目的实验目的v从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶v进行酶活分析进行酶活分析实验原理实验原理碱性磷酸单酯酶（EC:3.1.3.1）又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶，官方英文名为Alkaline phosphatase 碱性磷酸单酯酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中其用途一般有：1）在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸2）去除DNA片段5’磷酸以防止质粒DNA连接和自身环化 最适温度37℃，最适pH10，对底物只具有相对的专一性，在碱性条件下水解磷酸酯： 单磷酸酯＋水 醇＋磷酸 高浓度盐溶液处理MgCl2破壁破壁抽提抽提透析处理纯化纯化硫酸铵处理盐析除盐析除杂蛋白杂蛋白v盐析 根据不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同而利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出的方法称为蛋白质的盐析实验材料v枯草杆菌发酵液vTris－HCl缓冲液（pH7.4、9.5）v1mol/L MgCl2 溶液v40mmol/L 对硝基酚磷酸（NPP）溶液实验步骤v细胞培养与收集每组取约50mL枯草杆菌发酵液8000rpm离心5min，收集菌体弃去上清。

用pH7.4的Tris－HCl缓冲液洗涤菌体一次并弃去上清v碱性磷酸酶的提取得到菌体沉淀后，每管加入5mL pH7.4的Tris－HCl缓冲液，使细胞重悬然后再加入1mL 1mol/L MgCl2 溶液，于室温振荡10min；8000rpm离心5min，取上清液即为粗酶液取样测酶活v硫酸氨盐析将上述粗酶液，缓慢加入硫酸铵粉末，使之达到50％饱和度（313g/L），12000rpm离心5min，去除杂蛋白沉淀取上清液，再加固体硫酸铵，使之浓度分别达到70、75、80、85、90％ 充分溶解后，12000rpm离心5min得到粗酶沉淀v透析处理沉淀用2mL pH7.4的Tris－HCl缓冲液溶解，装进透析袋，在室温下透析1周取样测定纯品酶活v酶活测定溶液溶液加量加量pH9.5 Tris－HCl缓冲液750μ LNPP250 μ L样品0.5ML37℃保温10min0.5mL 0.5M NaOH 终止反应稀释至10mL酶活力单位：在420nm波长吸光度每变化0.001定义为酶的一个活力单位实验结束实验结束卫生大扫除卫生大扫除11。