实验四细菌转导PPT课件.ppt

实验四 细菌转导厦门大学生命科学学院实验目的n通过大肠杆菌噬菌体专一性转导半乳糖发酵基因学习掌握局限性转导的原理，掌握转导实验的基本方法噬菌体介绍噬菌体是指细菌病毒生活周期：吸附、侵入、复制合成、装配、释放•烈性噬菌体如T4•温和噬菌体如、Mu-1、P1和P2等噬菌体结构噬菌体组装λ噬菌体载体证明遗传物质是DNA而非蛋白质的Hershey-Chase实验溶源菌的形成噬菌体整合进大肠杆菌染色体中的固定位点上，这个位点在gal(半乳糖代谢基因)和bio(生物素合成基因)之间，这位点称为BOB’，它与的附着位点POP’有相同的核心序列区，由15bp组成，它们通过同源单交换发生整合，形成溶源菌实验原理n转导定义： 以噬菌体作为媒介将一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体）的过程n普遍性转导P1和P2n局限性转导λ λdg λdb实验材料n菌株：E.coli k12(λ)gal+ k12Sgal-n用品：Eppondoff离心管(1.5ml/4.5ml) Tip枪头(1ml/200ul/20ul)n培养基(肉汤固体/半固体/加倍肉汤/EMB)n试剂：氯仿、磷酸buffer 实验步骤n噬菌体的诱导和裂解液的制备n取4ml gal+菌液至离心管，4000rpm，5minn倒去上清，加3ml磷酸buffer，震荡悬浮n将悬浮液倒入培养皿，UV照射处理10sn加入3ml加倍肉汤，37℃避光培养2hn取0.8ml培养液于小离心管，加入0.2ml氯仿剧烈震荡半分钟，6000rpm, 10minn得到的上清液即噬菌体裂解液实验步骤n噬菌体效价测定n取10ul裂解液至990ul磷酸buffer, 震荡混匀，再从中取10ul裂解液至990ul磷酸buffer，震荡混匀，得到10-6稀释液n取0.1ml稀释液和0.5ml gal-受体菌至半固体肉汤培养基(3ml)管中，混匀，倒入肉汤固体培养基中，摇匀，凝固后37℃培养过夜n观察出现的噬菌斑数，计算效价 实验步骤n转导方法n取1ml gal-受体菌，4000rpm, 5min, 弃上清，加入1ml磷酸buffer，制成受体菌悬浮液n取一环受体菌在EMB培养基上划线(如图)， 37℃培养1.5h, 再滴加裂解液后培养2天n各加50ul gal-受体菌和裂解液于EMB培养基上, 混合涂布；另外再作对照涂布培养 混合液对 照作业n填表n结果分析，计算噬菌体效价和转导频率 效价(单位/ml)=斑数x稀释倍数x取样量 转导频率=(转导子数/ml)/(噬菌体数/ml)x100%n画图表示λdg转导颗粒转导gal-细菌的过程。