综述无缝克隆与基因融合(中文版).doc

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使 我们可以対分子进行精确的研究本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这 些杂交分子的方法刖B随着各种基因组测序项目的完成，人们越來越关注基因产物的功能分析基因融合技术在基 因功能研究的许多方面具有重耍的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互 换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验传统的基因融合技术涉及到type II限制輛消 化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被川來作为构建杂交基因的标准方法然 而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点这些多余的序列可以改变 DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不 需耍的影响，因此影响对融合基因精确的研究这篇综述讨论了精确融合基因的应用Z处, 概括了实现无缝基因融合的方法无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段粕确结合在一起，在DNA片段的接合处 没冇任何不需要的序列这是获得杂交基因的理想情况以下强调儿个例子，以表明无缝棊 因融合的重要性启动子和外显子研究基因启动了含有许多调控元件。

转录因了与它们结合并互相影响来调控转录启动了删除分 析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息然而，因为不同调控元 件Z间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋 面基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术分子演化方法例 如外显子和DNA转移来获得具有需耍生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝 拼接在真核细胞中，通过内含了介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白在这些 实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因只要 杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现蛋白质功能研究和蛋白质工程蛋白质由有功能结构域构成为了阐述一个蛋口某个结构域的功能，需要构建该结构域删除 或者被相似结构域替换的突变体这种结构域删除或者互换实验将在很人程度上得益于相关 元件的无缝融介，来消除冇操作序列所带来的潜在的负面影响更加概括地说，不同结构域 的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的朵交分子和抗体改造对丁•抗体改 造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。

嵌合体蛋白也可以通过內 含肽介导的蛋口拼接和连接获得只要含有內含肽的前体蛋口没有多余的序列，精确蛋白融 合就可以实现蛋白质表达标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来 的目的蛋白的亲和纯化在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融 合蛋白可以直接用到接F来的研究中对于酶学研究和测定，通常是这种悄况然而，在许 多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋片酶酶切位点来完成这个过程需 要蛋口酶切位点和目的蛋口Z间无缝的连接为了进行功能研究，在一些情况下携带一•个短 标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结品，移除这个标签是不必要的然而，如果带 冇标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋口氨基酸序列与原來的一样例如 RANTES （调控激活,正常的T表达和分泌）蛋白,interleukin-18 （IL-18）, IL-13和hirudin 蛋白的表达在这些蛋白的N端加上甲硫氨酸残基严重地降低了这些蛋白的活性对于 RANTES, Met-RANTES被发现是天然RANTES的描抗剂。

如果要在大肠杆菌中表达完整N端蛋 白，一个实用的方法就是将蛋白与N端标签融合表达并纯化°纯化和重折叠（如果需耍）Z 麻，通过专一改造的蛋白酶酶切位点将标签和不需要的序列切除这个过程需要蛋白酶切位 点和目的蛋口Z间的无缝拼接肠激酶，Xa因子和泛素特异性蛋口酶（Ubps）是常用的酶， 这些酶可以切开识别序列的C端烟草蚀刻病毒蛋白酶对于酶切位点下游的氨基酸残基耍求 比较宽松，也可以用來去除融合标签ubiquitin/Ubp可能是笫一个用來在体内和体外获得 完整N端蛋白蛋白的系统在人肠杆菌中表达成熟的人类Apo A-1蛋口，Mogilevsky和同 事发现泛素标签系统是最宜接的方法之一基因组操纵在模式生物中冃的基因的敲除和敲入技术是体内分析革因功能的有力工具这个过程常常包 括整个开放阅读框或者一部分编码特殊结构结构域的棊因的删除，在一些情况下利用一个等 位基因突变休或者同源基因序列的替换这些研究需要产牛敲出和敲入的载体，在具中所有 的功能元件包括侧翼序列，需要同源重组楮确地连接到一起无缝基因融合技术将会显著地 促进载体构建Link及其同事利用重叠PCR技术获得基因精确删除的载体，用以在大肠杆 菌基因组中进行功能研究。

为了进行动物病毒繁荣分子和病理学研究和疫苗载体开发，经常需要合成整个病毒基因组或 者改造朵交病毒载体利用无缝基因融合技术看，Tount和同事用PCR片段成功地拼接了 31.5Kb的重纟R病毒基因无缝基因融合技术在PCR技术发明Z前，DNA片段的无缝融合是通过复杂的程序完成的，涉及到利用细菌的基 于噬菌体Ml 13的定点突变，多核芹酸引物,linker和核酸外切陆，质粒在大肠杆菌中扩增 在一些情况卜.需要利用RecA依赖的同源重组这些过程盅要仔细的设计载体，需要复杂的 程序由于传统方法的局限，仅仅有几例利用这些方法进行无缝基因融合一个例了就是利 用一组突变载体进行基因启动子的link扌描分析，另一个就是酵母小蛋口稳定性分析 随着PCR技术的出现，无缝基因融合有了很大的发展已经发展了几种无缝基因融合的方法, 许多其他方法经过修饰也可以用于此冃的这些方法将在下面讨论并列举在表1中PCR常 常是用來进行精确的DNA操控或者修饰DNA元件的末端用來进行合适的基因融合利丿IJ这些 创新的方法，我们操控DNA序列的水平达到了一个而所未有的水平例如，在研究P1'氨 基酸残基对肠激酶酶切融合蛋白的影响中，通过一种PCR和连接不依赖克隆的无缝垄因融介 技术构建了 20个GST - EK - X - calmodulin融合基因（其中X代表20个氨基酸的一种,GST 是谷胱甘肽-S转移腮）。

重叠PCR在PCR技术发明之后就出现了重叠PCR技术重叠PCr是一种非常有效的过程，不依赖与任 和限制性酶切位点，在片段都可以扩增的前体下，任何两个片段都可以在任何确定的位点自 由地结合到一起利用相同的原则，多个DNA片段可以无缝拼接到一起，并成功地获得了 20 kB的重组融合基因重叠PCR已经被用以无缝的方式來进行点突变，插入，删除和替换 到一个基因的任何位置PCR获得的融合基因随后可以克隆到合适的载体以进行卜-游应用 需要主意的是，重亞PCR的一个特例是基因合成，互相重穂的多核甘酸被用来作为PCR模板 进行基因拼接如果没有合适的模板DNA进行PCR扩增，或/和杂交基因相对较短（500 bp）, 就可以采用这种方法定点突变定点突变，包括点突变，插入，删除和替换，是在包含一个目的基因的坏形质粒模板上进行 删除，插入或者替换突变通常是通过PCR完成反相PCR利用两个方向相反的引物去扩增质 粒，得到质粒任何位点点突变，删除和插入的突变体然而，PCR步骤会潜在地在质粒中引 入错误序列这个问题可以通过QuickChangeemutagenesis technology解决如图2所示， 该方法依赖于两条完全互补的突变引物和PfuWK聚合酶°因为引物彼此是完全互补的而且 々b没有链替换活性，在热循环过程中，突变的双链是以原始DNA为模板线性扩增的。

因此， 这种设计避免了 DNA合成过程小错谋的扩增QuickChange技术及其改进技术可以用來在模 板DNA的任何位点进行DNA插入，删除或者序列替换，甚至可以同吋将多个片段插入模板中Il S型内切酶的应用I1S型限制性内切酶是一类可以从酶切位点外部将DNA切开的酶，例如Sciplt Bscil a和尸 它们被用來得到PCR片段的粘性末端，进行基因和病壽基因组的拼接对于一些通用的基因, 例如用于蛋白表达的纯化标签（例如麦芽糖结合蛋白），这个基因通常先插入农达载体然 后，这个载体可以作为受体，将不同的片段通过无缝克降插入该载体Stratagene的 pCal. n. EK载体是一个大肠杆菌表达载体，包含17/JacO - CBP - EK - MCS表达序列（CBP： 钙结合肽MCS：开放阅读松）利用typellS内切酶&M104可以将目的基因DRF无缝地融 合到CBP-EK的下游CBP-EK-0RF融合蛋口表达和纯化后，用肠激酶切除CBP-EK多肽，可 以得到完整的目的重组蛋白在IMPAC™载体pTYB和pTWIN中，利用S矽I可以使目的蛋白 的0RF与內含肽无缝融合，以进行蛋片表达和随后的蛋白拼接。

11S型限制性酶切位点也被用來构建目的载体以进行无缝克隆，使一个DNA片段与载体中己 存在的DNA片段无缝融合这是通过在质粒上的反向PCR实现的，引物包含IIS型限制位点 然后进行限制性酶切，得到带冇所盂要粘性末端的载体值得一提的是，基于I IS型限制性 内切酶的方法需要同时消化载体和待插入的DNA片段如果在DNA片段内部含有某种ITS 型内切酶的腮切位点，可以将该位点甲基化，來抑制酚将片段从中间切开或者换一种HS 型内切酶片段和载体可以如图3a所示拼接在一起连接非依赖克隆（LIC）为了克服传统构建杂交基因的的切/粘贴方法的限制，人们开发了 I」C克隆，不依赖与限制 性内切酶和连接，将PCR片段克降到载体小该方法依赖于具有3, -5,外切卿活性的DNA 聚合酶（T4或者戶他聚合陆）,在DNA片段5'端产生12个碱基的单链因为其独特的特征， LIC已经被用来无缝连接编码蛋白结构域的0RF,进行蛋白质的表达利用含有核糖核营的 嵌介引物进行PCR,用其他试剂比如尿嗨呢DXA糖卄酶或者rare-earth metal ions处理PCR 产物，也可以得到粘性末端Jarmll及其同事采用包含三个连续的核糖核井或者一个 2' -0-甲基化核糖核昔来终止DNA在互补链的合成，在PCR过程中得到单链末端。

应为这种 方法简单，可以促进高通量克隆实验In-Fusion™ PCR克隆系统可以将末端含有与载休片段末端有15bp同源序列的片段克隆到任 何线性化载体然而，这种酶的成分还没有公开因为末端对于这种反省是非常重要的，载 体片段需要特殊的处理，来实现插入片段与载体中已存在的ORF无缝融合载体片段可以通 过反向PCR制备或者用HS型限制性内切酶处理，去除不需要的序列In-Fusio芒是迄今 为止授为直接的PCR克降系统，它将会促进PCR克降的自动化体内重组同源重组可以使含有同源区域的分子中的遗传序列相互交换因为同源重组的位点可以自山 地选择，利用同源重组可以进行棊因的无缝操作这个过程曾被用于等位基因的替换，研究 人肠杆菌和酵母细胞中基因的功能这通常是一个两步同源重组的过程首先将带有-正选择 标记和负选择标记的环形质粒整合到染色体或者附加型载体目的ORF的特界位点上重组子 通过正选择标记筛选接卜•來，通过负选择标记反向选择，川另外一个包含修饰ORF的片段 替换选择的片段在这个过程中，基因是以无缝的方式在染色体上操作的在酵母中，基因 的在质粒上的操作是通过一步缺口修复完成，只需要30 bp的同源愕。

使用PCR技术，用來 进行缺口修复实验的杂交载体町以利用删除，插入和序列替换构建酵母-大肠杆菌-哺乳动。