多肽及蛋白质类药物的生产方法ppt课件.ppt

             第二节第二节 多肽及蛋白质类药物的生产方法多肽及蛋白质类药物的生产方法   一、蛋白质类药物的分离与纯化一、蛋白质类药物的分离与纯化 制造方法：提取分离纯化法、化学合成法、基因工程制造方法：提取分离纯化法、化学合成法、基因工程  （一）材料选择（一）材料选择    蛋白质类药物的原料来源有动动植植物物组组织织和和微微生生物物等，原原则则是要选择富富含含所所需需蛋蛋白白质质多多肽肽成分的、易易于于获获得得和易于提取易于提取的无害生物材料   对天然蛋白质类药物，为提高质质量量、产产量量和降降低低生生产产成成本本，对原料的种种属属、发发育育阶阶段段、生生物物状状态态、来来源源、解解剖剖部部位位、生生物物技技术术产产品品的的宿宿主主菌菌或细细胞胞都有一定的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍1  （（1））种种属属 牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为4000IU／kg胰脏，猪为3000IU／kg胰脏抗抗原原性性猪比牛的低前者与人人胰胰岛岛素素相比，只有1个个氨氨基基酸酸的差异，而牛有3个氨基酸个氨基酸的差异2））发发育育生生长长阶阶段段 幼年动物的胸胸腺腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须胸腺原料必须采自幼龄动物。

      HCG在妊娠妇女60～70天的尿中达到高峰；到妊娠18周已降到最低水平然而HMC必须从绝经期的妇女尿中获取      肝细胞生生长长因因子子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎胎儿儿、、胎胎猪猪或或胎胎牛牛肝肝中中获得的若用成年动物，必须经过肝脏部部分分切切除除手手术术后后，才能获得富富含含肝肝细细胞胞生生长长因因子子的原料2 （（3））生生物物状状态态 动物饱饱食食后后宰宰杀杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆胆囊囊收收缩缩素素的分泌使胆胆汁汁排排空空，对胆汁的收收集集不不利利严严重重再再生生障障碍碍性性贫贫血血症患者尿中的EPO含量增加含量增加  （（4））原原料料来来源源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，而稳稳定定性性以以颚颚下下腺腺来源为好，因其不含蛋白水解酶蛋白水解酶  （（5））原原料料解解剖剖学学部部位位 猪胰脏中，胰胰尾尾部分含激素较多，而胰胰头头部分含消消化化酶酶较多如分分别别摘摘取取则可提高各产品的收率    胃胃膜膜素素以采取全全胃胃粘粘膜膜为好，胃胃蛋蛋白白酶酶则以采取胃底部粘膜底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺胃底部粘膜富含消化腺。

3 （（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求     选择生物技术产品的宿宿主主受受体体菌菌或细细胞胞也应考虑到后后处处理理的问题大大肠肠杆杆菌菌表表达达，由于其不能将所表达的蛋蛋白白质质分分泌泌到体外，故提取时必须破破壁壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类毒素类有害因子       用枯枯草草杆杆菌菌或或酵酵母母菌菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖糖基基化化等翻译及修饰的缺陷；     用动动物物细细胞胞和和昆昆虫虫细细胞胞表表达达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题       用肿肿瘤瘤细细胞胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑到其安全性问题安全性问题4蛋白质提取l总要求是最大限度的把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择l常用方法：调整溶剂的pH、离子强度、溶剂成分配比、温度等5（（二）蛋白质分离纯化的一般方法二）蛋白质分离纯化的一般方法    根根据据蛋蛋白白质质在在溶溶液液中中的的下下列列性性质质分分离离蛋蛋白白质质：：分分子子大大小小、、溶溶解解度度、、电电荷荷、、吸吸附附性性质质、、对对其其他他分分子子的的生物亲和力等。

生物亲和力等1、根据蛋白质、根据蛋白质等电点的不同等电点的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质    蛋蛋白白质质、、多多肽肽及及氨氨基基酸酸都都是是两两性性电电解解质质，，在在一一定定pH环环境境中中，，某某一一种种蛋蛋白白质质解解离离成成正正、、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，，或或解解离离成成两两性性离离子子，，其其净净电电荷荷为为零零，，此此时时环环境境的的pH值值即即为为该该蛋蛋白白质质的的等等电电点点在在等等电电点点时时蛋蛋白白质质性性质质比比较较稳稳定定，，其其物物理理性性质质如如导导电电性性、、溶溶解解度度、、粘粘度度、、渗渗透透压压等等皆皆最最小小，，因因此此可可利利用用蛋蛋白白质质等等电电点点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质6    两性物质的等等电电点点会因条件不同（如在不同离离子子强强度度的的不不同同缓缓冲冲溶溶液液中，或含有一一定定的的有有机机溶溶媒媒的溶液中）而改变当当盐盐存存在在时时，蛋白质若结合了较多的阳离子，则等电点向较高的pH值值偏偏移移反之，蛋白质若结合较多的阴离子，则等电点移向较较低低的的pH值值     用等等电电点点法法沉沉淀淀蛋白质常需配合盐盐析析操操作作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作热变性操作。

      等电聚焦电泳等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质分离蛋白质外，也可用于测定测定蛋白质的等电点等电点 72、根据蛋白质、根据蛋白质分子形状和大小的不同分子形状和大小的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质    蛋白质的一个主要特点是分子大由此可以用凝凝胶胶过过滤滤法法、、超超滤滤法法、、离离心心法法及及透透析析法法等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离[注注意意]    用超超滤滤法法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈呈线线形溶质或者是球形溶质的区别形溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果    葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶含有少量的酸酸性性基基团团，故有较较弱弱的的离离子子交交换换作作用用，此外还有吸吸附附作作用用在纯化蛋白质时，可采用低低浓浓度度的的盐盐溶溶液液（（0.01mol／／L）），或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使使凝凝胶胶柱柱平平衡衡，以期不损失所分离的蛋白质83、根据蛋白质、根据蛋白质溶解度的不同溶解度的不同来纯化蛋自质来纯化蛋自质    蛋白质的溶溶解解度度受溶液的pH、离离子子强强度度、溶剂的电电解解质质性性质质及温温度度等多种因素的影响。

在同一特定条件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶溶解解度度，达到分离的目的    属于这一类的分离方法有蛋白质的盐盐溶溶与盐盐析析法法、结晶法结晶法和低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法     乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由于丙酮的介电常数丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮丙酮沉淀能力比乙醇乙醇强94、根据蛋白质、根据蛋白质电离性质的不同电离性质的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质    离子交换剂作为一种固固定定相相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯     蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团对蛋白质的离子交换层析，一般多用离离子子交交换换纤纤维维或或以以葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶、、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶等等为骨架的离离子子交交换换剂剂主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨率等优点     对已知等等电电点点的物质，在pH高于其等电点时，用阴阴离子交换剂离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂阳离子交换剂105、根据蛋白质、根据蛋白质功能专一性的不同功能专一性的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质    主要的手段是亲亲和和层层析析法法，即利用蛋白质分子能与其相应的配配体体进行特特异异的的、非非共共价价键键的的可可逆逆性性结结合合而达到纯化的目的。

   [注注意意] 非专一性吸附主要来自吸附剂上的离离子子基基团团和疏疏水水基基团团解决这一问题的方法是从制备和选用吸附剂上着手    固固相相化化金金属属亲亲和和层层析析（（IMAC））是新发展的一种亲亲和和层层析析技技术术蛋白质分子中的咪咪唑唑基基和和巯巯基基可与一些金金属属元元素素（（如如Cu2＋＋、、Zn2+等等））形形成成配配位位结结合合，使蛋白质得到分离纯化116、、根根据据蛋蛋白白质质疏疏水水基基团团与与相相应应的的载载体体基基团团结结合合来来纯化蛋白质纯化蛋白质   蛋白质分子上有疏疏水水区区，它们主要由酪酪氨氨酸酸、、亮亮氨氨酸酸、、异异亮亮氨氨酸酸、、缬缬氨氨酸酸、、苯苯丙丙氨氨酸酸等等非非极极性性的的侧侧链链密密集集在在一一起起形形成成，并并暴暴露露于于分分子子表表面面这些疏水区，能够与吸吸附附剂剂上上的的疏疏水水基基团团结结合合，再通过降降低低介介质质的的离离子子强强度度和和极极性性，或用含含有有去去垢垢剂剂的的溶溶剂剂，增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来    用含含酚酚基基疏疏水水基基团团的琼琼脂脂糖糖纯纯化重组人表皮生长因子（rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。

127、、根根据据蛋蛋白白质质在在溶溶剂剂系系统统中中分分配配的的不不同同来来纯纯化化蛋蛋白白质质    这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆逆流流分分溶溶利用逆逆流流分分溶技术溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的138．根据蛋白质．根据蛋白质某些特殊性质某些特殊性质来纯化蛋白质来纯化蛋白质l 蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、、温度、酸、碱、金属离子、蛋白沉淀剂、络合剂蛋白沉淀剂、络合剂等的影响，由于各种蛋白质都存在着差异，可利用这种差异来纯化利用这种差异来纯化蛋白质蛋白质l 白蛋白白蛋白在弱酸性条件下弱酸性条件下加辛酸钠辛酸钠可耐受耐受67℃的温度的温度，而其他蛋白质将变性l球蛋白或白蛋白在碱性条件下碱性条件下，可以和利凡诺利凡诺作用，形成络合物络合物而与其他蛋白质分离细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀三氯醋酸沉淀，而保存其活力     149、、根根据据蛋蛋白白质质的的选选择择性性吸吸附附性性质质来来纯纯化化蛋蛋白白质质     在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结结晶晶磷磷酸酸钙钙（（羟羟灰灰石石））、磷磷酸酸钙钙凝凝胶胶、硅硅胶胶、皂皂土土沸沸石石、硅硅藻藻土土、、活活性性白白土土、、氧氧化化铝铝以以及及活活性性炭炭等。

诸如催产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞色素C等都可以通过吸吸附附层层析析技技术术进行纯化15（三（三〕〕蛋白质的分离和纯化方法的选择蛋白质的分离和纯化方法的选择     早早期期：：从从低低分分辨辨率率到到高高分分辨辨率率，，而而且且负负荷荷量量较较大大为合适     使用顺序：使用顺序：    后期保护：后期保护：    对分离纯化每一步的优劣进行综合评价对分离纯化每一步的优劣进行综合评价16（四）溶液中蛋白质浓度的测定（四）溶液中蛋白质浓度的测定      溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物物理理、、化化学学性性质质，如折射率、比重、紫外光吸收来测定折射率、比重、紫外光吸收来测定；      化化学学反反应应方方法法，如凯凯氏氏定定氮氮、、双双缩缩脲脲反反应应、、福福林林-酚酚反反应应测测定定；也可用染色法，如氨氨基基黑黑、、考考马马斯斯亮亮蓝测定；蓝测定；      此外还可用荧荧光光激激发发、、氯氯胺胺T、、放放射射性性同同位位素素计计数等灵敏度较高数等灵敏度较高的方法    上上述述方方法法，紫紫外外吸吸收收法法、、双双缩缩脲脲法法、、福福林林－－酚酚试试剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用。

17（五）纯度检查（五）纯度检查    测定蛋白质的纯度纯度是化学和物理学化学和物理学的概念，它和蛋白质所具有的生物活性生物活性有着更复杂的关系，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性生物活性，而这些因素的影响有些往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的，纯度检查的方法有：1、、HPLC或或FPLC      这是蛋白质纯度检查常用的有效方法美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中 182、电泳法、电泳法  3．免疫化学法．免疫化学法（适用于产生特异性抗体的蛋白）4．生物测定法．生物测定法      利用动物体或动物的离离体体器器官官、、细细胞胞进进行行生生物物效效价价的的测测定定，这种方法接近动物临床所产生的生生物物学效应学效应，因此实际意义也更大5、分光光度法、分光光度法（（1）紫外分光光度法）紫外分光光度法（2））红红外外分分光光光光度度法法 (蛋白分子结构有特别能级，红外提供分子指纹)19二、多肽与蛋白质的化学合成二、多肽与蛋白质的化学合成      多肽的合成是50年代开始，在有有机机溶溶剂剂中中进行的均均相相反反应应，因此叫作液液相相合合成成法法，此法在合成分子量不太大的多肽时是比较成功的，但在合成更大的蛋白质时，产物还不能表现出全部活力表现出全部活力且不能结晶不能结晶，           1962年建立的固固相相合合成成的新新方方法法，对小肽的合成是很成功的，对大分子的合成，如124肽肽的核糖核酸酶，还不能达到天然物质的全部活力天然物质的全部活力。

     目前试图合成大的蛋白质以及建建立立快快速速简简便便的的合合成方法成方法是多肽合成化学的特征特征  20在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤：   ①①氨基保护和羧基活化氨基保护和羧基活化；②②羧基保护和氨基活化羧基保护和氨基活化；③③接肽和除去保护基团接肽和除去保护基团 （一）基团保护（一）基团保护           要实现控制多肽合成，如N-末末端端氨基酸残基的自由-NH2、C-末末端端氨基酸残基的自由-COOH以及侧链上的一些活活泼泼基基团团，加以封封闭闭或或保保护护待肽链形成之后，再将保护基除去作为保护基，必必须须既既能能在在接接肽肽时时起起到到保保护护作作用用，，在在接接肽肽以以后后，，能能很很容容易易地地除除去，且不致引起肽链的断裂去，且不致引起肽链的断裂21      应用最多的氨氨基基保保护护剂剂是苄苄氧氧羰羰酰酰氯氯（（Cbz-Cl）），可用催催化化氢氢化化法法或钠钠氨氨法法（用用金金属属钠钠在在液液氨氨中中处处理理）除除去去保保护护基基，也可用叔叔丁丁氧氧羰羰酰酰氯氯（（BOC-Cl））作保保护剂护剂，用稀盐酸或乙酸稀盐酸或乙酸在室温除去保护基室温除去保护基。

       羧羧基基保保护护剂剂通常用无无水水乙乙醇醇或或甲甲醇醇在在盐盐酸酸存存在在下进行酯酯化化，使羧基接接上上烷烷基基除去保护基可在常温下用氢氧化钠皂化法氢氧化钠皂化法      有些氨氨基基酸酸还有其他功功能能基基团团，在合成肽时，都要用适当的保护基团加以保护例如组氨酸的咪咪唑唑基基、丝氨酸的羟羟基基、酪氨酸的酚酚基基、半胱氨酸的巯巯基基等，都可用苄苄基基（（—B2））保保护护，用钠钠氨氨法法除去谷氨酸和天门冬氨酸的β－及γ-羧羧基基可用β-及及γ-苯苯甲甲酯酯保护，用催催化化氢氢化化法法除去精氨酸的胍胍基基用对对甲甲基基磺磺酰酰基基（（Tos-）保护）保护22（二）肽的液相合成法（二）肽的液相合成法       接肽反应除用缩缩合合剂剂来完成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨氨基基和和羧羧基基的方法来完成因活活化化氨氨基基的反应激烈，而且常常产生消消旋旋化化，所以，总是采用羧羧基基活活化化的方法，合成肽的常规方法是从C-端向端向N-端进行端进行        肽的合成法可分为阶阶梯梯伸伸长长法法和片片断断缩缩合合法法阶阶梯梯伸伸长长法法是将带有R-O-CO-型型保保护护基基的氨基酸（不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸，逐步递增的办法。

这是合成比较小的肽或肽段常采用的方法23片断缩合法片断缩合法   由小肽合成大肽时常用叠叠氮氮法法，因叠氮法有较好的产品光学纯度（不消旋）     由小肽接成大肽时，为了保证光学纯度，应尽量利用Gly和和Pro这两个氨基酸的C-末端接肽末端接肽                 24（三）肽的固相合成法（三）肽的固相合成法       在固相合成中，肽链的延长是在不溶性的聚聚苯苯乙乙烯烯树树脂脂载载体体上上进进行行的的合成多肽肽的C-末末端端先和氯甲基聚苯乙烯树脂（氯化苄酯树脂）反应形成苄苄酯酯，然后按肽肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长   固相法比液相法操作简便，时间缩短，可可以以自自动动化化在我国医药工业用人工合成催产素、促黄体生成素释放因子（LRH），不仅产量高，而且比天然产品好2526多肽类药物多肽类药物（一）概述（一）概述         活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，生物体内已知的活活性性多多肽肽主主要要是是从从内内分分泌泌腺腺、、组组织织器器官、分泌细胞和体液中产生或获得的官、分泌细胞和体液中产生或获得的     许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋蛋白白质质前前体体，经过酶酶的的加加工工剪剪切切转化而来的有共同的来源，相似的结构，保留着若干彼此所特有的生物活性生物活性。

       研究活活性性多多肽肽结结构构与功功能能的关系及活性多肽之间结结构构的的异异同同与与其其活活性性的的关关系系，将有助于设设计计和和研研制制新的活性多肽药物27   多肽药物的种类多肽药物的种类1、多肽激素、多肽激素2、多肽类细胞生长调节因子、多肽类细胞生长调节因子3、含有多肽成分的其他生化药物、含有多肽成分的其他生化药物 28二、主要多肽类药物的制备二、主要多肽类药物的制备（一）胸腺激素（（一）胸腺激素（Thymus hormones））       胸胸腺腺是是一一个个激激素素分分泌泌器器官官，对免免疫疫功功能能有多方面的影响胸胸腺腺依依赖赖性性的淋淋巴巴细细胞胞群群——T细细胞胞直接参与有关免疫反应     胸腺对T细细胞胞发发育育的的控控制制，主要通过由胸腺所产生的一一系系列列胸胸腺腺激激素素，促使T细胞的前身细胞——前前T细细胞胞分分化化、、增增殖殖、、成成熟熟为T细胞的各种功能亚群，由此控控制制调调节节免免疫疫反反应应的的质质与与量量现已知某些免免疫疫缺缺陷陷病病、自自身身免免疫疫性性疾疾病病、恶恶性性肿肿瘤瘤以及老年性退化性病变等皆与胸胸腺腺功功能能的减退及血中胸胸腺腺激激素素水平的降低有关。

291、胸腺素（、胸腺素（Thymocln））         胸腺激素制剂胸腺激素制剂总的说来都与调节免疫功能有关都与调节免疫功能有关    （（1））结结构构和和性性质质 胸腺素组分5是由在80℃热热稳稳定定的40~50种种多多肽肽组成的混混合合物物，分分子子量量在在1000～～15000之间之间，等电点在等电点在3.5～～9.5之间之间     为了便于不同实验室对这些多肽的鉴鉴别别和和比比较较，根据它们的等等电电点点以及在等等电电聚聚焦焦分分离离时的顺序而命名共分三三个个区区域域：α区区包括等电点低低于于5.0的组分，β区区包括等电点在5.0～～7.0之之间间的组分，γ区区则指其等电点在7.0以以上上者（此区内组分很少）对分离的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素有活性的称为胸腺素30（（2）生产工艺：）生产工艺：①①工艺路线工艺路线31②②工艺过程工艺过程提取提取  匀浆、离心匀浆、离心加热去杂蛋白加热去杂蛋白 提取液80℃加热加热15min，沉淀沉淀 -10℃丙酮丙酮， 超滤超滤  取分子量在15000以下的超滤液以下的超滤液脱脱盐盐、、干干燥燥 超滤液经Sephadex G-25脱盐后，冷冷冻冻干燥干燥得胸腺素。

3））检检验验方方法法：：活力测定：E-玫玫瑰瑰花花结结升升高高百分数不得低于10％％；分子量15000以下4）作用与用途：）作用与用途：为免疫调节剂322、胸腺肽（、胸腺肽（Thymus peptides））（（1））结结构构和和性性质质：胸腺肽中主要是分分子子量量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达15种种，必需氨基酸含量高，还含有RNA 0.2～0.3mg／mg，DNA0.12～0.18mg／mg对对热热较较稳稳定定，加温80℃生物活性不降低经蛋蛋白白水水解解酶酶作用，生物活性消失33（（二）降钙素（二）降钙素（Calcitonin，， CT））1、结构和性质、结构和性质      降降钙钙素素是一种调节血钙浓度的多多肽肽激激素素，由甲甲状状腺腺内的滤滤泡泡旁旁细细胞胞（C细细胞胞）分泌是由32个个氨氨基基酸酸残基组成的单单链链多多肽肽，降钙素肽链的脯脯氨氨酸酸端端与生物活性有密切的关系，去掉脯氨酸则失活脯氨酸则失活      降降钙钙素素分分子子量量约约3500，溶溶于于水水和碱碱性性溶液，不不溶溶于于丙丙酮酮、、乙乙醇醇、、氯氯仿仿、、乙乙醚醚、、苯苯、、异异丙丙醇醇及及四四氯氯化化碳碳等，难溶于有机酸。

水溶液中等，难溶于有机酸水溶液中2~10℃ 可保存可保存7天      降钙素降钙素在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中，鱼类则在鲑、鳗、鲑、鳗、鳟等的终鳃体鳟等的终鳃体里含量较多各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序有些差异排列顺序有些差异342、生产工艺、生产工艺      制造降钙素的原料主要有猪猪甲甲状状腺腺和和鲑鲑、、鳗鳗的的心心脏脏或或心心包包膜膜用化化学学合合成成和基基因因工工程程技技术术制备降钙素已获成功353、检验方法、检验方法      生生物物活活性性测测定定方方法法：样品用经过0.1mol／L醋酸钠溶液稀释过的0.1％白蛋白溶液溶解，取0.2ml样品按倍比稀释法配制，选用雄性大白鼠，静静脉脉注注射射1h收收集集血血液液血样品的血清钙值采用原原子子吸吸收收光光谱谱法法测测定定，对照采用MRC标准品，该标准品是从猪甲状腺中提取的将将标标准准品品稀释至所需要的稀释度2.5、5、10和20MRCmU／0.2ml，然后用用同同样样方方法法给给大大鼠鼠注注射射，1小时后测定血清钙值根根据据标标准准品品测测定定样样品品的的生生物物活活性。

性364、作用与用途、作用与用途        降钙素的主要功能是降降低低血血钙钙降钙素抑制骨的吸收，又能抑制骨自溶作用，使骨骼释放钙减少，同时骨骼不断摄取血浆中的钙，导致血钙降低，降钙素还可抑制骨盐的溶解与转移，抑制骨基质分解，提高骨的更新率，增加尿钙、尿磷排泄，引起低钙血症或低磷血症在体内的降低血钙作用很短暂，降钙素可对抗甲 状 旁 腺 激 素 对 骨 骼 的 作 用   37蛋白质类药物蛋白质类药物 一、概述一、概述    现正从微微生生物物和和动动物物细细胞胞的表表达达转向基基因因动动植植物物发展鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗抗原原性性、容容易易失失活活、在体内的半半衰衰期期短短、用用药药途途经经受限等难以克服的缺点，对一些蛋白质生化药物进行结结构构修修饰饰、应用计算机图像技术研究蛋蛋白白质质与受受体体及药物的相互作用、发展蛋蛋白白质质工工程程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物，并且起到增增强强或或增增加加选选择性择性疗效的作用等，已成为前瞻性的重要任务之一38主要蛋白质类药物有以下几类：主要蛋白质类药物有以下几类：1、蛋白质激素2、血浆蛋白质3、蛋白质类细胞生长调节因子4、粘蛋白5、胶原蛋白6、碱性蛋白质7、蛋白酶抑制剂    8、植物凝集素39二、主要蛋白质类药物的制备二、主要蛋白质类药物的制备（一）白蛋白（（一）白蛋白（Albumin））1、结构和性质、结构和性质     白白蛋蛋白白又称清清蛋蛋白白，是血浆中含量最多的蛋白质，约占总总蛋蛋白白的的55％％。

同同种种白蛋白制品无无抗抗原原性性主要功能是维持血浆胶体渗透压血浆胶体渗透压      白蛋白为单单链链，由575个个氨氨基基酸酸残基组成，分子量为65000，pI4.7，沉沉降降系系数数（（S20，，w））4.6，电电泳泳迁迁移移率率5.92可溶于水和半半饱饱和和的硫酸铵溶液中，一般当硫酸铵的饱和度为60％％以上时析出沉淀析出沉淀40       对酸较稳定对酸较稳定受热受热后可聚合变性聚合变性，但仍较其他血浆蛋白质耐热耐热，蛋白质的浓度浓度大时热稳定性小热稳定性小在白蛋白溶液中加入氯化钠氯化钠或脂肪酸的盐脂肪酸的盐，能提高白蛋白的热稳定性热稳定性，可利用这种性质利用这种性质，使白蛋白与其他蛋白质分离     白人血浆中分离的白蛋白有两种制品两种制品：    一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清白人血清白蛋白蛋白；       另一种是从健康产妇胎盘血胎盘血中分离制得的，称胎胎盘血白蛋白盘血白蛋白      制剂为淡黄色淡黄色略粘稠的澄明液体澄明液体或白色疏松状白色疏松状（冻干）固体 412、生产工艺、生产工艺（（1）工艺路线：）工艺路线： （（2）工艺过程：）工艺过程：提取、分离、精制提取、分离、精制利利凡凡诺诺沉沉淀淀   弱酸性，氯化钠  超滤器浓缩   热处理，灭活病毒   除菌（过滤）。

42（二）干扰素（（二）干扰素（Interferon，，IFN））1、结构和性质、结构和性质         干扰素（干扰素（IFN））系指由干扰素诱生剂诱导有关生物生物细胞细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质诱生蛋白质        这类诱生蛋白质诱生蛋白质从细胞中产生和释放产生和释放之后，作用于相应的其他同种生物细胞同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗抗病毒和抗肿瘤肿瘤等多方面的“免疫力免疫力”人干扰素按抗原性分为α、、β、、γ三型三型根据氨基酸序列的差异，又分为若干若干亚型亚型已知IFN－－α有有23个以上的亚型个以上的亚型，IFN-β的基因位于第9对染色体上，而IFN-γ的基因位于第12对染色体上三种干扰素的理化及生物学性质生物学性质有明显差异，即使是IFN-α的各亚型之间，生物学作用也不尽相同432、生产工艺、生产工艺       我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，达到106U／mg蛋白的水平基因工程α-干扰素我国已于1989年转入中试，1990年获得生产许可证而进入工业化生产阶段 (1)   工艺路线：工艺路线：44（（2）工艺过程：）工艺过程：         含有ACD抗抗凝凝剂剂塑料袋   氯氯化化铵铵处处理理溶溶血血    起起动诱生动诱生     正正式式诱诱生生  仙仙台台病病毒毒（在10天龄鸡胚中培养48～72h，收获尿囊液）3、检验方法、检验方法国际上规定，能保护50％细胞免受病毒攻击的浓度即为一个IFN活性单位。

我国用微量板染色的病变抑制法测定，具有操作方便、节约材料、快速、结果可靠、重复性好及便于保存标本等优点45本本法法测测定定 α、β、γ-干扰素可任选用Wish细胞、A549细胞和Hep-2细胞，细胞浓度40万个／ml左右，病毒为水泡口炎病毒（VSV）方法为：将细胞在微量板上培养，分别加测定样品和IFN标准品，待细胞已成单层即可攻毒，约24～30h待病毒对照的细胞几乎全部病变时，即可进行染色，在550nm波长比色，计算出IFN单位效价，再将测得的单位校正为国际单位464、作用与用途、作用与用途由于干扰素的抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节作用，可用于：（1）病毒性疾病 普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎2）恶性肿瘤 成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等，可获得部分缓解3）用于病毒引起的良性肿瘤可控制疾病发展47（三）胰岛素（（三）胰岛素（Insrlin））      胰岛素广泛存在于人和动动物物的的胰胰脏脏中，正常人的胰脏约含有200万万个胰岛，胰岛由α-、、β-和和δ-三三种种细细胞胞组组成成，其中β-细胞制造胰胰岛岛素素，α-细胞制造胰胰高高血血糖糖素素和胰胰抗抗脂脂肝肝素素，δ-细胞制造生生长长激激素素抑抑制制因因子子。

胰岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前前体体胰胰岛岛素素原原存在的，进而分解分解为胰岛素进入血液循环1．结构和性质．结构和性质     胰岛素由51个氨基酸组成      不同种属动物的胰岛素分分子子结结构构大大致致相相同同，主要差别在A链链二二硫硫桥桥中中间间的的第第8、、9和和10位位上上的的三三个个氨氨基基酸酸及及B链链C末末端端，，人人的的是是苏苏氨氨酸酸，，猪猪的的是是丙丙氨氨酸酸,抗抗原原性比性比其他来源的胰岛素要低484950胰岛素的性质有：胰岛素的性质有：        牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784胰岛素的等电点为等电点为5.30~5.35     胰岛素在pH4.5～～6.5范围内几乎不溶于水范围内几乎不溶于水，易溶于易溶于稀酸或稀碱溶液；在稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解以下乙醇或丙酮中溶解；在在90%以上乙醇或以上乙醇或80%以上丙酮中难溶以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶乙醚中不溶       在高高浓浓度度锌锌的溶液中，pH6～～8时胰岛素溶解度急剧下降 2、生产工艺、生产工艺      胰岛素在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定。

胰岛素在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定51工艺路线：工艺路线： 523、注解、注解（1）离离体体后后，蛋蛋白白水水解解酶酶类能分解胰岛素使之失活因此，要立即深深冻冻，，先先在在-30℃以以下下急急冻冻后后转转入入-20℃保存备用如用液氮或干冰速冻，效果更好保存备用如用液氮或干冰速冻，效果更好     在胰脏中，胰胰尾尾部部分分胰胰岛岛素素含含量量较较高高，如单单独独使使用可提高收率用可提高收率10 %2）胰岛素结构修饰 ，可对胰岛素分子进行修饰和改造，以改变某些性质，如提提高高降降血血糖糖能能力力、延长体内半衰期半衰期、抗热变性抗热变性、抗蛋白水解酶的降解抗蛋白水解酶的降解等53（（3））酶酶促促半半合合成成人人胰胰岛岛素素 经胰胰蛋蛋白白酶酶的转转酰酰胺胺作作用用，将猪猪胰胰岛岛素素转化为为人人胰胰岛岛素素B30再用离离子子交交换换层析纯化层析纯化，可得到高纯度人胰岛素4）重组DNA技术制造人胰岛素，人工合成的人胰岛素克隆到大肠杆菌中生产人胰岛素5455基因表达基因表达容易进行容易进行DNA重组技术操作重组技术操作    用于基因表达的宿主细胞分为两大类两大类，第一类为原第一类为原核细胞，核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌霉菌等；第二类为真核细胞第二类为真核细胞，常用的有酵母、丝状真酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞菌、哺乳动物细胞等。

 宿主细胞的选择宿主细胞的选择（（1）大肠杆菌）大肠杆菌 〔〔2〕〕枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 （（3）链霉菌）链霉菌 562、真核细胞、真核细胞 （（1）酵母）酵母 （（2）丝状真菌）丝状真菌 （（3）哺乳动物细胞）哺乳动物细胞 4、检验方法、检验方法     胰岛素效价测定，各国药典规定有家免血糖降低法和小鼠血糖降低法5、作用与用途、作用与用途     胰岛素是调节血糖水平的重要激素，能使血糖降低，57（四）生长素（（四）生长素（Growth hormone，，GH））1、结构和性质、结构和性质    人的生长激素是由一条191个个氨氨基基酸酸的多肽链所构成的蛋白质，等等电电点点4.9，（猪猪为为6.3），沉沉降降系系数数为为S20W2.179N端端的的1～～134氨氨基基酸酸段肽链为活性所必需，C端端的一段肽链可可能能起保保护护作作用用，使使生生长长激激素素在在血血循循环环中中不不致致被被酶酶所所破破坏坏人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冰冻冻条条件件下下可保持数数年年，在室室温温放放置置48h无无变变化化只有灵长类灵长类的生长激素对人有活性对人有活性58      生生长长激激素素与与催催乳乳素素的肽链氨基酸顺序约有近近一一半半是相同的，因此，生长激素具有弱弱的的催催乳乳素素活活性性，而催乳素也有弱的生长激素的活性弱的生长激素的活性 592、生产工艺、生产工艺（（1）工艺路线）工艺路线60（（2）注释：）注释：水、水、0.1％％mol/L、洗涤，、洗涤，0.25 ％％mol/L抽提。

抽提硫酸铵分级沉淀除杂，分级沉淀除杂，   分子筛分子筛   DEAE-C层析（强碱强碱）用与展层剂相似的展层剂相似的透析外液透析外液    hGH的种属特异性很强     目前用枯草杆菌系统表达hGH的最高产量达1.5g／L    用大大肠肠杆杆菌菌生产的hGH及用哺乳动物细胞生产的hGH，比比垂垂体体提提纯纯的的天天然然hGH多多一一个个蛋蛋氨氨酸酸，其治疗效果更为显著614、检验方法、检验方法 GH生物测定用鹤子嗉囊法及大白鼠尾骨法5、作用与用途、作用与用途62（五）胃膜素（（五）胃膜素（Gastric mucin）） 1、结构和性质、结构和性质   胃膜素是从猪胃胃粘粘膜膜中提取的一一种种以粘粘蛋蛋白白为主要成分的药物   胃胃膜膜素素着着水水后后膨膨胀胀成成为为粘粘液液，遇遇酸酸即即沉沉淀淀，遇遇热热不不凝凝固固，胃膜素水溶液能被被60％％以以上上乙乙醇醇或或丙丙酮酮沉淀胃膜素与酸较较长长时时间间作用，能分分解解成各种蛋白质和多糖组分胃膜素的等电点为等电点为pH3.3～～5632、生产工艺、生产工艺目前生产胃膜素的工艺以联产联产最为可取1）工艺路线：）工艺路线： 64（（2）工艺过程：）工艺过程： 消化消化   氯仿脱脂氯仿脱脂、分层   丙酮分级沉淀胃膜素、胃蛋白酶丙酮分级沉淀胃膜素、胃蛋白酶。

 3、检验方法、检验方法目前我国质量标准各地尚不一致4、作用和用途、作用和用途胃膜素中的粘蛋白能抵抗胃蛋白酶的消化并吸附胃酸，临床上用于胃、十二指肠溃疡和胃酸过多症65（六）绒膜促性激素（（六）绒膜促性激素（HCG））1、结构和性质、结构和性质:      HCG是一种糖糖蛋蛋白白，由α-链和β-链两个亚基100个氨基酸组成，分分子子量量47000～～59000其核心部分由氨基酸组成，以以共共价价键键与与寡寡糖糖链链相相结结合合，在糖链的末端带一负电的唾唾液液酸酸，每个HCG分子中约含20个个分分子子的的唾液酸唾液酸      易易溶溶于于水水，，不不溶溶于于乙乙醇醇、乙乙醚醚和和丙丙酮酮等等有有机机溶溶剂剂，等等电电点点pI3.2～～3.3干品稳定，稀溶液不稳定干品稳定，稀溶液不稳定662、生产工艺、生产工艺（（1）工艺路线：）工艺路线：67（（2）工艺过程：）工艺过程：         苯甲酸乙醇饱和液苯甲酸乙醇饱和液，用95％乙醇全部溶解苯甲酸洗脱， HCG沉淀          离子交换层析 梯度洗脱（PH）3000～4 000IU／mg          羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石柱层析  10000～12 000IU／mg 3、检验方法、检验方法    检测HCG生物活性，中国药典和美国药典均规定使用小白鼠子宫增重法， 日本药典规定使用大白鼠卵巢增重法。

中国药典规定＞1500U／mg，第二国际标准品10000～15000U／mg4、作用与用途、作用与用途68（七）人丙种球蛋白（（七）人丙种球蛋白（γ-lmmunoglobulin））1、结构和性质、结构和性质      免免疫疫球球蛋蛋白白是一类主要存在于血浆中、具有抗抗体体活活性性的糖糖蛋蛋白白对血清进行电泳后发现，抗体成分存在于β和和Y球球蛋蛋白白部分，故通称为免免疫疫球球蛋蛋白白（（Ig））免疫球蛋白约占血浆蛋白总量的20%除存在于血浆中外，也少量地存在于其它组织液、外分泌液和淋巴细胞的表面      根据免疫球蛋白的一些理化性质的差异，可将Ig分成五类，即IgG、、IgA、、IgM、、IgD和和IgE这五类Ig的主要理化特征见表13·1069702、生产工艺、生产工艺（（1）工艺路线：）工艺路线：3、检验方法、检验方法4、作用与用途、作用与用途本品具有被被动动免免疫疫、、被被动动-自自动动免免疫疫以以及及非非特特异异性性即负反馈作用，故可用于预防流行性疾病如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘及治疗丙种球蛋白缺乏症等71（八）白细胞介素（八）白细胞介素-2（（Interleukin－－2，，IL－－2））  1、结构和性质、结构和性质      白细胞介素（ILS）为淋淋巴巴因因子子家族的一员。

到目前为止，已发现的ILS已有十余种十余种    IL-2由活活化化的的淋淋巴巴细细胞胞所所产产生生，为含133个个氨氨基基酸酸残基的糖糖蛋蛋白白，其精确分子量为15420IL-2在较较宽宽的的pH范范围围内具有良好的热热稳稳定定性性，56℃1h稳稳定定，37℃7天不丧失活力天不丧失活力722、生产工艺、生产工艺  （（1）工艺路线：）工艺路线：73（（2）工艺过程：）工艺过程：    诱生诱生 用鸡瘟病毒和PHA（丝裂原培养基丝裂原培养基）联合刺激人外周血白细胞外周血白细胞，37℃培养培养       酸灭活病毒，硫酸铵分级沉淀灭活病毒，硫酸铵分级沉淀 ，梯度洗脱，PGE(聚乙二醇聚乙二醇)浓缩3、检验方法、检验方法744、作用与用途、作用与用途IL-2能诱诱导导T细细胞胞增增殖殖与与分分化化，刺刺激激T细细胞胞分分泌泌γ-干干扰扰素素，，增增强强杀杀伤伤细细胞胞的的活活性性，故在调整免疫功能上具有重要作用。