方法学验证培训课件.ppt

方法学验证,定义,方法验证：为了保证测定结果的可靠性和准确性，应对任何新的或修改的检验方法进行效能指标（验证参数）测定，这些指标是建立检验方法的实验依据验证参数,准确度 线性 精密度 （包括重复性与中间精密度 ） 专属性 检测限 定量限 耐用性,准确度,定义：结果与真值的接近程度，表示分析方法测定的正确性，通常用回收率实验表示（加样回收率） 回收率＝（测定液测定值－原样液含测值）/加入量值×100％ 准确度的测定至少要取方法范围内的3个浓度级别每个浓度级别至少要3个结果如某个方法的范围是80%～120%，则应取80%、100%、120% 3个浓度，每个浓度测三次，9个结果的相对标准偏差应符合要求，回收率均应在限度内 对于常量分析，回收率至少应在95%～105％之间；对于微量或半微量分析，回收率可根据仪器本身条件适当放宽准确度应在规定的范围内建立线性,定义：指所用分析方法在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力 所谓范围是指利用给定分析方法取得精密度、准确度、线性均符合要求的供试物浓度的变化范围(最大值与最小值间的间隔)，通常用百分数或mg／ml表示对于线性的考察，要在标准的50%范围内至少使用5个浓度。

浓度与其对应的测定值经二次回归得到相关系数r，对于化学分析，相关系数r应不小于0．9990；对于仪器分析，相关系数值不小于0．990．对此的任何偏离都将说明这一检验方法在这一浓度范围是不适用的，在这种情况下，应该修改检验方法精密度 （包括重复性与中间精密度 ）,定义：精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，即一组测量值彼此符合的程度测量值彼此愈接近，测量值的偏差愈小，测量就愈精密所以也称为重现性，亦称为变异系数，一般可用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示但是测量的精密度不能说明测量值与真值的关系，亦即精密度高并不等于准确度就一定高精密的测量值不一定是准确的，因为引起测量值远离真值的误差会对一系列的测量发生相同的影响，因而不影响精密度重复性：方法重复性的确定至少要取方法范围内的3个浓度级别，每个浓度级别至少要测定3次或取100%的样品浓度至少测定6次，一般地，对于化学分析方法，相对标准差(RSD)应不大于1．0％；对于仪器分析方法，RSD应不大于2．0％或根据仪器自身参数确定自动进样器重复性的测试，一般取同一样品溶液至少重复进样10次，相对标准差(RSD)应不大于1．0％； 中间精密度：中间精密度主要考察随机变动因素（如时间、人员、设备等）对精密度的影响，但不必对每个可能的影响因素进行单个的考察，可设计方案对其进行统一的考察。

色谱分析方法由于受外界因素的影响较大，故一般要求考察中间精密度，至少应在两种不同条件下进行考察（不同时间、更换实验人员）专属性,专属性是指在样品介质中有其它组份共存时，检验方法对供试物准确而专属的测定能力指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号）,检测限,定义：分析方法能从背景信号中区分出药物，所需样品中药物的最低浓度，反映方法与仪器的灵敏度和噪音也表明样品经处理后本底值的高低S/N3 （无需定量测定只需指出高于或低于该规定浓度即可，常用百分数，mg／ml或mg／L表示） 非仪器分析方法：通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限 仪器分析方法：可用已知浓度的样品与空白试验对照，以信噪比为2：l或3：l来确定检测限的最低水平；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，乘以2或3，作为检测限的估计值不论用哪种方法，均需制备相应检测限浓度的样品，反复测试来进行确定定量限,定义：定量限是指在样品介质中可定量测得的某一物质的最低水平的参数，例如原料药中的杂质或制剂中的降解产物等定量限规定的最低测得浓度应符合一定的精密度和准确度的要求定量限用百分数、mg／ml或μg／ml表示 对于非仪器分析方法，与检测限的非仪器分析方法所用方法相同，只足所得结果需符合一定的准确度和精密度；对于仪器分析方法，一般以信噪比10：1时相应的浓度作为定量限的估计值，然后配制相应定量限浓度的样品，反复测试来进行确定。

基本内容,检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批，检测仪器的确认，适用性验证(包括准确度试验、精密度测定、线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个方面按验证项目分类,（1）全部验证：第一次新建方法；一个已建方法，但增加分析对象（精密、回收） （2）部分验证（已建方法的部分改变）： 分析方法改变（检测器改变）； 生物样品（抗凝剂改变）； 基质改变（血－尿）； 前处理方法改变； 生物样品种属改变（大鼠－小鼠）； 仪器改变工作软件改变； 稀有生物样品，取样量有限 （3）交叉验证：样品分析在不同场所或实验室进行时，不同实验室需进行加样生物样品或实际样品分析，建立实验室间的重现性数据 当分析数据由不同检测技术产生时 需交叉验证按分析方法分类,薄层鉴别的方法学验证 容量分析法的方法学验证 HPLC法的方法学验证 UV法的方法学验证,薄层鉴别的方法学验证,证明在拟建立的方法中，样品斑点能否与对照斑点保持一致的保留，样品斑点能否有效分离，非主斑点是否对主斑点有干扰容量分析法的方法学验证,①精密度：用原料药精制品考察方法精密度，平行试验5个样本RSD≤0.2%； ②准确度：以测定原料精制品（含量99.5%）的回收率（测定值与理论值的比值）计算，应在99.7%～100.3%之间（n＝5,RSD≤0.1%）； ③滴定终点确定的依据：包括滴定曲线的绘制，如用指示剂法确定终点，应用电位法校准终点颜色，提供指示剂颜色与电位变化情况的对比结果； ④耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明。

HPLC法的方法学验证,精密度：RSD≤2%（n＝5）； 准确度：用于制剂时，要考察辅料的影响，将一定量药物加到按处方比例配制的辅料中（为标示量的80%～120%）制成高、中、低三个剂量，混合均匀后，每个剂量取三份样品，按拟定方法测定回收率，应在98%～102%之间（n＝9, RSD≤2%） 线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n＝5～7），用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r≥0.999，截距应趋于零，并提供线性关系图； 专属性：辅料、有关物质或降解产物峰对主药峰应无干扰； 耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、流动相组成和pH值、不同品牌或批号的同类色谱柱、柱温、流速、样品提取次数、时间等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明； 灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求UV法的方法学验证,精密度：RSD≤1%（n＝5）； 准确度：方法同HPLC法，回收率应在98%～102%之间（n＝9, RSD≤2%），同时要求辅料、有关物质或降解产物在测定波长处无吸收 线性范围：用已知含量的精制品配制一系列浓度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.2～0.7间），用浓度C对峰面积A或峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，线性方程的相关系数r应≥0.999，截距应趋于零，并提供线性关系图； 耐用性：考察测定条件（供试液稳定性、样品提取次数、时间、比色法中显色剂用量、反应温度、时间、pH值等）有微小变动时，测定结果不受影响的承受程度，如测试条件要求苛刻时则应在方法中注明； 灵敏度：作为常量分析法，此项可不作主要要求。

再验证,（1）仪器更新或大修； （2）对检验方法获得的结果作趋势分析，发现系统性偏差； （3）对检验规程进行了修改或检测条件发生变更。