结核病实验室诊断现状与进展课件.ppt

结核病实验室诊断现状与进展,武汉市结核病防治所 检验科任易,目 录,1. 结核分枝杆菌的致病性和免疫性,2. 结核病的临床检验,3. 结核病的生化检验,4. 结核病的免疫学检验,5. 结核病的微生物学检验,6. 结核病的分子生物学检验,结核分枝杆菌的致病性和免疫性,,（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核 （2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关其主要包括：①磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关 ②分枝菌酸：与抗酸染色性有关③索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关④硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用⑤ 蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应 （3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫结核病的临床检验,现状： 三大常规（血常规、尿常规、大便常规） 血沉 血流变检测 肺结核患者血液粘滞性、凝固性、聚集性均增高，血流缓慢，易于促成肺内微血栓形成——《微循环学杂志》常规检测，无特异性结核病的临床检验,进展： 结核分枝杆菌抗原检测（标本多样化）类似于快速液体培养技术。

结核病的生物化学检验,现状： 腺苷脱氨酶（ADA）:其血清/浆膜腔积液比值更有意义 C反应蛋白 （CRP）: X线提示有空洞的结核病人比没有空洞的结核病人以及健康人显著升高但是CRP正常不能排除结核病——Infection.17(1):13-4,1989 Jan-Feb 辅助治疗检测：肝功能、肾功能、血脂、血糖 NSE 、AFU等指标用于鉴别诊断 超敏C反应蛋白：肺结核是结核分枝杆菌感染导致机体细胞免疫功能下降的慢性呼吸道传染病，患者血清中HS—CRP、免疫球蛋白、补体可发生改变 ——《中国实验诊断学》 2009年01期,结核病的生物化学检验,进展： ADA的低表达与奎诺酮呈相关性表现——《中国药物滥用防治》2011-01 CA 125标志的使用——《中国实用内科杂志》2003年 第2期 CA125可以作为结核病疗效判断指标结核病与肺部肿瘤患者均升高 鉴别诊断标志物——新蝶呤(neopterin,Np) 是反映“淋巴细胞-巨噬细胞轴”所介导的细胞免疫状态的较好标志物Horak等通过对7例耐药肺结核患儿研究发现,耐药者较不耐药者尿Np均值高出近5倍,推测尿Np水平可能与结核耐药有关结核病的生物化学检验,降钙素原（PCT）——感染标志肺结核患者血清PCT水平明显低于社区获得性肺炎（CAP）患者，HIV阴性的肺结核患者血清PCT水平并不会明显增高，故可用于PTB和CAP的鉴别诊断，但当PCT水平大于正常值时，其预后价值较差。

可作为肺结核和肺结核伴感染诊断的辅助指标——[Eur Respir J 2011; 37(2):371],结核病的免疫学检验,现状： 结核抗体检测 方法： 1.ELISA 2.胶体金标记 3.蛋白芯片 4.PPD(迟发超敏反应),结核病的免疫学检验,免疫学检验的意义： 结核病的诊断与鉴别诊断，尤其对菌阴肺结核、儿童结核、无痰患者及肺外结核的诊断及鉴别诊断具有重要参考价值 也可作为器官移植术并发结核感染的监测指标 用于结核病流行病学调查 各家报道的结核抗体检测敏感性和特异性不同，有的甚至差异很大，结果难有可比性结核病的免疫学检验,进展 1.特异性多抗原复合标记检测结核抗体 2.r-干扰素检测,代表性：T-spot,结核病的微生物学检验,现状： 1.涂片 2.培养 3.药敏试验 4.菌型鉴定微生物检验是结核病实验室诊断的金标准,结核病的微生物学检验,结核病的微生物学检验,传统药敏试验,结核病的微生物学检验,直接法：用标本(涂片1+以上)直接检测优点: 可以较快获得耐药谱缺点: DST 失败/接种量/活力-间接法：对结核分枝杆菌培养物进行药敏试验优点: 更好地控制接种量/活力缺点: 结果延迟,结核病的微生物学检验,WHO (1963) 标准方法 绝对浓度法- Meissner - 标准化的接种量; 梯度的药物浓度 抗性比率法- Mitchison - 克服了培养基中药物浓度的控制 比例法- Canetti / Grosset - 在临界药物浓度下的耐药比例，能够更好的克服由接种量引起的变异1961 informal meeting: G Canetti/ J Grosset (France); S Froman (USA); P Hauduroy (Switzerland);M Langerova/ L Sula (Czechoslovakia); HT Mahler (WHO); G Meissner (Germany); DA Mitchison(England),结核病的微生物学检验,传统药敏试验复杂的程序: 必须在有质量保证的实验室中开展 最危险的步骤：只能在拥有良好安全设施和设备（BSL-3）的条件下开展,结核病的微生物学检验,不同实验室操作（韩国）实验室工作人员结核感染风险的比率,结核病的微生物学检验,进展 1.涂片:LED发光二极管荧光显微镜光源寿命长（30,000h） 不需要预热 不需要暗室 可用现有的显微镜 可使用电池电源,结核病的微生物学检验,中盖项目LED评估结果 与初诊患者 LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000）随访患者 LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000） .0%,结核病的微生物学检验,2.液基薄层制片技术 痰标本消化灭活 基片的夹层杯 离心 细菌附着在基片 在夹层杯中直接染色 取出基片 于载玻片上 镜检 阅片计算机报告系统。

直涂法、罗氏培养和夹层杯法检测结果比较 .___________________________________ 642份晨痰__ 1140份即时痰_阳性数 阳性率% 阳性数 阳性率% 直涂法 82 12.8 109 9.6 罗氏培养 171 26.6 266 23.3夹层杯法 151 23.5 206 18.1_,,结核病的微生物学检验,3.培养进展 液体培养基（米氏7H9培养基） 双相培养基 全自动仪器法(法国梅里埃公司的BacT/Alert 3D分枝杆菌培养系统，美国BD公司的MGIT960系统),结核病的分子生物学检验,现状 PCR real-time 实时荧光定量PCR技术：也称分子信标技术，是近年发展起来的核酸定量技术是PCR与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的高特异性相结合结核病的分子生物学检验,进展 分子生物学 LAMP( 等温扩增) LPA( 线性探针) Genechip(基因芯片) GeneXpert( 多色巢式定量PCR) 分子分型技术,结核病的分子生物学检验,（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan 可同时检测患者是否感染结核所用仪器设备极其简单63 ℃扩增（避免非特异性扩增多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6个不同区域，设计4种引物 •对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 •密闭系统(没有污染的风险） •快速，两小时内即可得到检测结果， •肉眼观察,结核病的分子生物学检验,结核病的分子生物学检验,（2） 线性探针检测技术（LPA） 可进行结核杆菌复合群的鉴定 可用于MDR-TB高危人群的筛查 对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变) 对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最常见突变) 检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本 内部控制保证了结果的正确 可以获得商品化的试剂盒 约五小时内即可得到检测结果 需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室,结核病的分子生物学检验,耐药分子诊断的基本原理 利福平/异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。

结核病的分子生物学检验,结果判读,结核病的分子生物学检验,中盖项目线性探针检测MDR评价WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008 通过系统评估和META分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本 MDR-TB检测准确性：99%结核病的分子生物学检验,WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008线性探针分析不能替代目前传统的培养和药敏试验，涂阴标本和XDR-TB的证实都需要进行传统的培养结核病的分子生物学检验,（3）Genechip(基因芯片) 基因芯片指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量结核病的分子生物学检验,结核病的分子生物学检验,结核耐药检测基因芯片 基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼） 通 量：两个一线抗结核药 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍） 灵敏度：103 CFU/反应 特异性：对照设计严谨；自动判读,结核病的分子生物学检验,（4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术 是一种半定量巢式实时PCR的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。

扩增出ropB基因含有81bp的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列 集样本准备、扩增和实时检测于一体 盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液使用6色激光检测装置对靶核酸进行实时检测结核病的分子生物学检验,标本类型：临床痰标本，或浓缩处理后的标本（涂阳或涂阴培阳），不能用于用于治疗随访的病人 • 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 •可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 • 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单 •不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室,结核病的分子生物学检验,结核病的分子生物学检验,（5）分子分型技术 结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究结核病的分子生物学检验,DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用,,,,,,,抛砖引玉,实验耐药=临床耐药？,,How does genetic diversity impact a person’s response to drugs? 遗传多态性如何影响人对于药物的反应？,,,SNP(single nucleotide polymophism)，即单核苷酸多态 是决定个体差异的最主要的遗传基础。

SNP特点SNP的存在导致生物个体之间大量功能蛋白是不同的，这就导致了对药物反应的不同不同基因型个体的用药临床表现,,,FDA要求在药品说明书中注释相关的基因多态性,。