B细胞表面标志的检测.doc

B细胞表面标志的检测B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息一、B细胞表面抗原的检测B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测健康成年人外周血CD20阳性细胞约占淋巴细胞总数的8％～12％二、B细胞受体的检测B细胞表面有膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标一）SmIg的检测大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高特异性和高和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig，即IgM、IgG、IgA、IgE等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有SmIgM的细胞数为最多B细胞经荧光标记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同的形式，开始均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。

这一现象是由于淋巴细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动当SmIg抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状，时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮二）Fc受体和补体受体的检测B细胞表面具有与IgGFc段结合的受体，极易与抗原抗体复合物中抗体Fc段牢固结合，故用相应抗体致敏的红细胞(EA)作批示物，在一定条件下，它能与带Fc受体的B细胞形成EA花环，故称EA花环试验而细胞表面的补体受体，则能与红细胞(E)-抗红细胞抗体(A)-补体(C)复合物(EAC)中的补体相结合，从而建立EAC花环试验但由于单核细胞、巨噬细胞、NK以及部分T细胞也带有Fc或补体受体因此形成EA和EAC花环并非B细胞所特有，加上该类试验需制备新鲜指示物，操作麻烦，目前基本上已被其他试验所取代，甚少应用三）小鼠红细胞受体的检测部分B细胞能与小鼠红细胞形成花环，慢性B细胞白血病患者外周血淋巴形成小鼠红细胞花环率高达60％～85％，但健康人该花环率仅占总淋巴细胞的5％～10％，据此推知形成该花环的性能是某些B细胞亚群的标志，由于方法简便，临床可用作鉴定不同型淋巴细胞白血病。

一、体内试验B细胞受抗原或促有丝分裂原刺激后，可行分裂增殖并分化成熟为抗体生成细胞，且分泌相应的IgB细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig和血型抗体量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体，故临床定量测定受检者血清中各种Ig量和相应血型抗体，可判断B细胞功能，也是诊断体液免疫缺陷的指标反之，如血清中一种或多种Ig或轻、重链片段异常增高，表明B细胞产生Ig的功能异常增高此外给患者注射适量常用的抗原，如白喉类毒素、破伤风类毒素等蛋白质抗原，或肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等多糖抗原，经一定诱导期后，用适当的方法测定受检者血清中相应抗体的效价，根据抗体的水平也可判断受检者体内B细胞的功能实验室常用如下的体外试验检测B细胞功能二、B细胞早期活性指标的测定B细胞经不同抗原激发即开始分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪器加以检测激活的B细胞表面MHCⅡ类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC法检测三、溶血空斑形成试验经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置37温育。

由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少这种直接法所测至的细胞为IgM生成细胞，其它类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体(如兔抗鼠Ig)，使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA与抗Ig抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况如果用一定方法将SRBC用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的应用范围较大现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验SPA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围在该测试系统中，加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc段可与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。

此法可用于检测人类外周血中的IgG产生细胞，与抗体的特异性无关用抗IgA、IgG或IgM抗体包被SRBC，可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，这种试验称为反相空斑形成试验溶血空斑形成试验可用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，或评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能四、B细胞增殖能力的试验（一）不同刺激物诱发增殖试验抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养1～3天以后，加3H-TdR，与淋巴细胞增殖试验一样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度二）葡萄球菌诱导试验葡萄球菌CowenⅠ株（SAC）表面富含SPA该试验不依赖T细胞的参与，操作原则是将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cmp值葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转化能力成正比三）荧光法检测原则是用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心法上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光，缺点是活细胞释放的荧光常被效应细胞和培养液等所粹灭另外，荧光分析法常遇细胞自然释放率高，荧光本底强，影响灵敏度为克服上述障碍，用时间分辨荧光免疫分析，将靶细胞用镧系元素铕（Eu3+）的螯合物标记，按同法与效应细胞共温后，用时间分辨荧光计检测荧光，可除去非特异性荧光本底。

本法实验时间短，效靶细胞仅需共温2h，检测速度快，特异性强检测原则是将效应细胞和靶细胞按一定比例混合温育后，直接检测靶细胞分有靶细胞浆释放法和胞核释放法1．胞浆释放法常用51Cr释放法51Cr透过细胞膜与胞浆中小分子蛋白质结合，一旦细胞膜遭破坏，同位素随蛋白质外溢，并且不会被完整的细胞再度摄入本法操作简便快速能定量，缺点是自然释放率高，所需靶细胞数量多，51Cr半衰期短近年有用111In（铟）检测NK细胞活性，优点是标记率高，用量微，以γ射线放射，可释放90％的自身能量，比51Cr高10倍，自然释放率低，仅为51Cr的一半2．胞核释放法常用3H-TdR或125IudR作为DNA合成的前体物，可被摄入靶细胞核内当效应细胞和靶细胞共温后，用胰酸和DNA酶处理可使遭破坏的胞核内容物释放本法自然释放率比51Cr低，半衰期较长，方法的敏感性高，故被大多数实验室所采用。