化妆品中山梨酸脱氢乙酸含量测定方法.doc

附件3：化妆品中山梨酸、脱氢乙酸的检测方法（征求意见稿）1 范围本方法规定了采用高效液相色谱法测定化妆品中山梨酸（CAS：110-44-1）和脱氢乙酸（CAS：520-45-6）含量的方法本方法适用于膏霜、乳液、水剂和啫喱等化妆品中山梨酸、脱氢乙酸的测定2 方法提要以甲醇为溶剂提取化妆品中山梨酸和脱氢乙酸，用高效液相色谱仪进行分离，二极管阵列检测器检测，以保留时间和紫外吸收光谱定性，以峰面积定量本方法对山梨酸和脱氢乙酸的检出限均为6 ng，定量下限均为15 ng，如以取样0.2 g计，检出浓度均为0.006 %，定量下限浓度均为0.015 %3 试剂除另有规定外，试剂均为分析纯，水为一级实验用水3.1 甲醇3.2 甲酸3.3 甲酸溶液：取甲酸（3.2）1 mL加水至1000 mL3.4 乙腈，色谱纯3.5 山梨酸，纯度≥ 99 %3.6 脱氢乙酸，纯度≥ 99 %3.7 混合标准储备液（ρ=0.6 g/L）：准确称取山梨酸和脱氢乙酸标准品各0.03 g，精确到0.0001 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容4 仪器4.1 高效液相色谱仪具二极管阵列检测器4.2 超声波清洗器。

4.3 0.45 µm滤膜4.4 离心机，10000 r/min4.5 涡旋振荡器4.6 天平,感量0.0001 g5 分析步骤5.1 样品预处理准确称取样品0.2 g（精确至0.001g），置于具塞比色管中，加入甲醇（3.1）定容至10 mL，涡旋振荡30 s，使试样与提取溶剂充分混匀，超声提取20 min（工作频率20～43KHz，200 W），必要时以10000 r/min离心5 min取上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为试样溶液备用必要时用适当甲醇（3.1）稀释滤液备用5.2 色谱参考条件色谱柱：C18柱（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相：乙腈（3.4）+甲酸溶液（3.3）= 25+ 75；流速：1 mL/min；检测波长：二极管阵列检测器，检测波长290 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 µL5.3 标准曲线的制备用甲醇（3.1）将混合标准储备液（3.5）稀释成含山梨酸和脱氢乙酸6.0、12.0、24.0、60.0、120 µg/mL的混合标准溶液依次从混合标准溶液中取5 µL注入高效液相色谱仪，记录各次色谱峰面积并绘制峰面积-浓度曲线并计算回归方程5.4 测定取5 µL待测试样溶液注入高效液相色谱仪，根据峰的保留时间和紫外光谱图定性，根据峰面积从回归方程中查出待测试样溶液中山梨酸、脱氢乙酸的浓度，按“6 计算”计算样品中山梨酸和脱氢乙酸的含量。

5.5 平行实验按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %6 计算式中： w——样品中山梨酸或脱氢乙酸的质量分数，%； ρ——测试溶液中山梨酸或脱氢乙酸的浓度，µg/mL； V——样品定容体积，mL； m——样品取样量，g7 色谱图脱氢乙酸山梨酸图1 山梨酸、脱氢乙酸色谱图色谱峰：山梨酸TR=7.7 min，脱氢乙酸TR=11.1 min8 精密度与准确度 多家实验室验证，山梨酸低浓度时平均回收率为92.4%～99.5 %，相对标准偏差小于1.3%；高浓度时平均回收率为97.1%～99.5 %，相对标准偏差小于1.4 %（n=6）；脱氢乙酸低浓度时平均回收率为90.9%～99.5 %，相对标准偏差小于1.6 %；高浓度时平均回收率为95.4%～99.0 %，相对标准偏差小于1.7 %（n=6）化妆品中山梨酸、脱氢乙酸含量测定方法起草说明为加强化妆品中限用物质的监督管理，进一步提高化妆品产品使用安全性，国家食品药品监督管理局委托广东省药检所开展了化妆品中山梨酸、脱氢乙酸含量测定方法的起草和验证工作现就起草工作有关情况说明如下：一、 起草的必要性山梨酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，广泛应用于食品、饮料、烟草、农药、化妆品等行业，对霉菌、酵母、好气性细菌和丝状菌等均具有抑制作用，但对厌气菌和嗜酸乳杆菌无效，其抑菌作用比杀菌作用强。

据报道如果食品中添加的山梨酸超标严重，消费者长期服用，在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康我国《化妆品卫生规范》（2007年版）表4中规定，山梨酸及其盐类作为化妆品中限用防腐剂，化妆品中最大允许使用浓度为0.6 %（以酸计）脱氢乙酸是一种低毒高效防腐、防霉剂，在酸、碱条件下均有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强在我国《化妆品卫生规范》（2007年版）表4中规定，脱氢乙酸及其盐类作为化妆品中防腐剂，化妆品中最大允许使用浓度为0.6 %（以酸计）目前我国虽然有食品、药品等产品中山梨酸和脱氢乙酸的检测方法，但尚无统一和权威的化妆品中山梨酸和脱氢乙酸含量的专用测定方法为进一步提高化妆品中限用防腐剂山梨酸和脱氢乙酸的管理，广东省药检所对其在化妆品中的含量测定方法进行了研究并起草了本方法二、 起草依据及参考文献目前国内化妆品中山梨酸和脱氢乙酸等防腐剂含量测定方法方面的研究，由于山梨酸和脱氢乙酸是食品中常用的添加剂，故食品中山梨酸和脱氢乙酸含量测定的方法都有相应的国家标准，相关的研究和报道也有很多作为药品辅助原料成分，《中国药典》对此有详细的规定，国外药典中也有类似的详细检测方法规定，这些对于本方法的建立都有十分重要的参考作用。

部分相关的起草依据和文献资料如下：（一）化妆品卫生规范（2007版）二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范三）The cosmetic Directive of Council European Communities, 76/768/EEC.（四）中国药典（2010版，第二部）五）GB/T 5009.29-2003 食品中山梨酸,苯甲酸的测定方法六）GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法七）GB 21703-2010 乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的测定八）GB/T 23377-2009 食品中脱氢乙酸的测定 高效液相色谱法九）陈伟光,刘亚苓,韩青；化妆品中7种防腐剂同时测定的气相色谱法[J]；环境与健康杂志，2006，23（2）：171-173十）姚浔平，李小平，姚珊珊，金米聪；高效液相色谱法同时测定食品中10种添加剂；中国卫生检验杂志，2009，19（1）：9-11十一）蔡志斌，张英，刘丽；超高效液相色谱法同时测定冷饮中12种食品添加剂；实用预防医学，2011，18（1）：138-141三、起草原则本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的精确性和重现性。

四、起草过程国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司（以下称保化司）于2011年4月委托广东省药检所开展化妆品中间山梨酸检测方法的建立和验证工作我们在查阅国内外相关文献资料等调研工作后，即刻开始了实验研究，2011年5月初完成了该方法的建立工作我所于9月初委托三家检验机构进行实验室验证三家验证单位按照协议书要求，陆续将验证材料报送我单位，我们将三家实验室方法验证材料进行整理、总结和分析，对方法进行完善2011年11月30日，我所组织召开了方法的专家研讨会，包括来自广东省疾控中心、广州市质检院等化妆品检验机构的共5位专家，对方法进行了全面的梳理及讨论会后，我们根据专家意见，对方法进行了进一步的完善后，形成此稿报送保化司2012年1月9日，保化司组织召开专家论证会，认为该方法基本满足现阶段化妆品中上述物质的检测要求，并提出了相关修改意见根据专家论证会意见，项目承担单位对检测方法进行了修改完善，并经2012年2月29日保化司司务会讨论通过后形成此征求意见稿五、重点说明的问题（一）关于体例本检测方法的体例主要参照现行2007版《化妆品卫生规范》的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。

二）关于山梨酸和脱氢乙酸山梨酸化学名2,4-已二烯酸，英文名sorbic acid或hexa-2,4-dienoic acid，CAS编号110-44-1山梨酸属于酸性防腐剂，对霉菌、酵母、好气性细菌和丝状菌等均具有抑制作用，其防腐效果受pH影响，一般pH值愈低，防腐能力愈强山梨酸防腐原理是它能与微生物酶系统中的巯基(-SH)结合，形成共价键，使微生物失去活力从而达到抑制微生物增殖和防腐效果作为一种高效、低毒防腐剂山梨酸类常用于食品行业，其防霉能力是苯甲酸及盐的5-10倍，但毒性只是苯甲酸盐的1/4、食盐的1/2目前我国生产化妆品中较少添加山梨酸作为防腐剂，较多见于进口化妆品中目前欧盟EEC和我国《化妆品卫生规范》（2007年版）表4中规定，山梨酸及其盐类作为化妆品中限用防腐剂，化妆品中最大允许使用浓度为0.6 %（以酸计）脱氢乙酸化学名3-乙酰基-6-甲基-2H-吡喃-2,4(3H)二酮，别名二乙酰基乙酰乙酸，英文名dehydroacetic acid，CAS编号520-45-6脱氢乙酸是一种低毒高效防腐、防霉剂，在酸、碱条件下均有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强目前欧盟EEC和我国《化妆品卫生规范》（2007年版）表4中规定，山梨酸及其盐类作为化妆品中限用防腐剂，化妆品中最大允许使用浓度为0.6 %（以酸计）。

目前国内市面上含脱氢乙酸的化妆品较少，我们未能采购到含有脱氢乙酸的样品三）关于检测方法的建立和验证山梨酸和脱氢乙酸含量常用的检测方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、电位滴定法和紫外分光光度法等电位滴定和紫外分光光度法比较适合成分简单、纯度较高的药品分析；气相色谱法灵敏度较高，方便，但是前处理较复杂以及杂质影响较大；液相色谱法适用的范围较广，适用于多种物质的同时测定，并且结果准确、可靠由于化妆品的剂型较多，所包含物质也较复杂，对于多种物质的含量测定，选用高效液相色谱法是一种比较合适的方法经过对化妆品中山梨酸和脱氢乙酸样品前处理方法分析、选择和优化，我们建立了化妆品中山梨酸和脱氢乙酸含量的高效液相色谱测定方法方法实验室内验证表明，本方法的山梨酸和脱氢乙酸定量限浓度为0.006 %，定量下限浓度为0.015 %，在6~120 μg/mL浓度范围内呈线性（相关系数＞0.99），平均回收率在85 %~115 %范围内，平均相对标准差小于10 %上述结果表明，本方法可以满足化妆品中山梨酸和脱氢乙酸的检测要求化妆品中山梨酸、脱氢乙酸含量检测方法的编制说明一、 基本信息1 简介山梨酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，广泛应用于食品、饮料、烟草、农药、化妆品等行业，对霉菌、酵母、好气性细菌和丝状菌等均具有抑制作用，但对厌气菌和嗜酸乳杆菌无效，其抑菌作用比杀菌作用强。

山梨酸溶于乙醇和乙醚，不溶于水，其化学性质与一元酸类似，可与碱反应生成盐脱氢乙酸是一种低毒高效防腐、防霉剂，在酸、碱条件下均有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强，可作为化妆品的防腐剂使用脱氢乙酸易溶于碱的水溶液，难溶于水，1g约溶于35mL乙醇或5mL丙酮，其饱和水溶液pH约等于42 属性信息2.1 山梨酸2.1.1 中文名：2，4-已二烯酸2.1.2 英文名称：sorbic acid或hexa-2,4-dienoic acid2.1.3 INCI名称：sorbic acid。