限制酶的选择和筛选方法 学案.docx

选修三 专题一 基因工程 单元复习限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定班级： 姓名： 小组： 【学习目标】1．掌握重组表达载体构建过程中限制酶的选择方法2．简述目的基因检测与鉴定方法【重点难点】 难点、重点：构建重组质粒时限制酶的选择及筛选方法【知识链接】一、 基因工程的基本工具1. 限制酶：（1） 来源：主要从 生物中分离纯化而来；（2） 作用：识别 并切开特定部位的两个核苷酸之间的 ；（3） 结果：产生 或平末端；2. DNA连接酶：（1） 作用：将限制酶切割下来的DNA片段 ；（2） 类型： 和T4 DNA连接酶；3. 载体：作为基因表达载体所需的元件：目的基因、 、 、标记基因二、 基因工程的基本操作程序目的基因的获取→ （核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定【思考与讨论】1.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图中’表示相关限制酶的酶切位点。

限制酶EcoR ⅠBamH ⅠPstⅠHind ⅢSmaⅠNotⅠ识别序列及切割位点G↓AATTCCTTAA↑GG↓GATCCCCTAG↑GCTGCA↓GG↑ACGTCA↓AGCTTTTCGA↑ACCC↓GGGGGG↑CCCGC↓GGCCGCCGCCGG↑CG请回答下列问题：（1） 用图中含目的基因的外源DNA构建重组质粒时，不选择SmaⅠ切割，原因是_________________________________________________________________________2） 与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于：__________________________________、_____________________________________3）如果使用右图质粒构建重组质粒，质粒上有多个酶切位点，其中AmpR表示青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因，Ori表示复制原点，所有限制酶切割形成的末端均不相同：①不选择限制酶SmaⅠ、SacⅠ的原因是： ②不选择限制酶XhoⅠ、NcoⅠ的原因是： ③不选择限制酶EcoRⅠ的原因是： ④结合目的基因所在DNA上的酶切位点，应选择哪些限制酶切割？理由？________________________________________________________________________________________________________________________________。

4）如果选择BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶对外源DNA和质粒进行酶切后，使用DNA连接酶进行连接，那么酶切回收的产物共有几种？请将连接产物黏贴于下方方框内（仅考虑2个片段的连接）（5）将酶切产物导入受体细胞大肠杆菌后，如何从转化产物中筛选含有目的基因的受体细胞？请回答一下问题①转化后有几种大肠杆菌？ ；②接种到甲培养基上的目的是：筛选______________的大肠杆菌③接种到乙培养基上的目的是：筛选______________的大肠杆菌④含目的基因的菌落位于哪个培养基上？在图中相应位置上圈出来？______________【总结】1. 限制酶的选择原则：（1） 应选择切点位于目的基因 的限制酶，以便将目的基因“切出”；（2） 不能选择切点位于目的基因 的限制酶，以防破坏目的基因；（3） 为避免目的基因和质粒的 和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，即为“双酶切”法2. 根据质粒的特点确定限制酶的种类（1） 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶 ，以确保具有 的黏性末端；（2） 质粒作为载体必须具备标记基因，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有 个完好的标记基因用于筛选；（3） 所选限制酶切点不应位于 处以防破坏质粒的自我复制能力；（4） 所选限制酶，其切点应位于 与 之间，以确保目的基因可以借载体在受体细胞内表达。

3. 若质粒为Ti质粒，那么限制酶切点应位于 片段中，因为Ti质粒的T-DNA最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上随堂小测】1、转基因抗病香蕉的培育过程如图1所示，图2表示PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点请据图回答下列问题：（1）图中限制酶切割DNA时破坏的是两个_____________之间的化学键2）在构建图1中的重组质粒时要保证目的基因被连接在质粒上特定的______ 和终止子之间才能保证目的基因在受体细胞中被成功________3）将抗病基因从含抗病基因的DNA中切割下来，使用的限制酶是______________，同时也应该用相同的酶对质粒进行切割，这样处理的原因是________________________________4）转基因抗病香蕉的培育是否发生了可遗传变异？______________药物A会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可以利用含药物A的培养基筛选已导入重组质粒的香蕉细胞由此推断，重组质粒中应含有________________基因作为标记基因2、大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的运载体。

某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β－半乳糖苷酶当培养基中含有IPTG和X－gal时，X－gal便会被β－半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落反之，则形成白色菌落下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程请分析并回答：(1)其中目的基因的获取可以通过 、 、 2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复________键3)将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是_________________________；大肠杆菌需事先用Ca2＋进行处理，目的是____________________________________4) 将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质碳源、氮源、无机盐、水和生长因子，还应加入IPTG、X－gal以及 ，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出__________________________5) 若观察到培养基上出现______色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。

如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是_____________________________________________________________________________。