结核病防治规划培训.doc

一、实验室生物安全实验室环境安全：根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《人间传染的病原微生物名录》和《医疗机构临床实验室管理办法》的要求，对结核分枝杆菌大量活菌操作须在符合生物安全三级（BSL-3）的环境中进行；对样本检测（包括涂片、显微观察、样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取等初步检测活动）可以在符合生物安全二级（BSL-2）的环境中进行实验室所用设施、设备和材料（含防护屏障）均应符合国家相关的标准和要求实验操作安全：具有相关专业知识和操作技能的工作人员进行实验室操作，实验人员应该认真负责，严格按照标准化、规范化的操作程序进行各项实验室操作菌种或样本运输安全：为保障人体健康和公共卫生安全，在运输可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求进行包装、运输、操作、保藏和管理废弃物处理安全：对医疗废弃物，为了防止疾病传播，保护环境，保障人体健康，医疗废弃物的处理应该严格按照《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》以及《医疗废物管理条例》的相关规定妥善处理医疗废物。

一）痰涂片镜检实验室基本要求1. 实验室应有实验室分区（涂片染色区域和读片镜检区域），布局应该符合生物安全二级（BSL-2）防护的要求；2. 准入规定：在实验室门上应该标有国际通用的生物危害警告标志，未经批准的人员不可进入实验室工作区域，实验室的门应该随时关闭；3. 个体防护：在实验室工作时，应该穿防护服、隔离衣，配戴口罩（面具）和手套等；4. 实验室墙壁、天花板和地板应当易清洁、不渗液以及耐化学品和消毒剂的腐蚀，地面应防滑；5. 实验操作台面应能耐热防水，耐消毒剂、酸、碱和有机溶剂的腐蚀；6. 实验室内应保证操作时的照明，避免不必要的反光和闪光；7. 实验室应设置洗手池、洗眼器或喷淋设备；8. 实验室中的器具、实验台应坚固耐用，在实验台、生物安全操作柜和其他设备之间及其下面应有足够的空间以便于清洁卫生；9. 实验室中可开启的窗户，应安装纱窗；10. 实验室应有适当的消毒设备；11. 在实验室门口处应设挂衣装置，个人便装与实验室工作服分开放置；12. 实验室应该装备开展痰涂片检查所需要的仪器和设备二）结核分枝杆菌培养实验室基本要求1. 满足国家生物安全二级（BSL-2）的基本要求；2. 准入规定：在实验室门上应该标有国际通用的生物危害警告标志，未经批准的人员不可进入实验室工作区域，实验室的门应该随时关闭；3. 个体防护：在实验室工作时，应该穿防护服、隔离衣，配戴口罩（面具）和手套等；4. 实验室墙壁、天花板和地板应当光滑、易清洁、不渗液以及耐化学品和消毒剂的腐蚀，地面应防滑；5. 实验操作台面应能耐热防水，耐消毒剂、酸、碱和有机溶剂的腐蚀；6. 实验室门应带锁并可自动关闭，实验室的门应有可视窗；7. 实验室内应配备二级生物安全操作柜、高压蒸汽灭菌器以及分离培养所需的设备等；8. 应设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置；9. 有可靠的电力供应和应急照明。

必要时，重要设备如培养箱、生物安全操作柜、冰箱等应设备用电源；10. 实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识；11. 应有足够的存储空间摆放物品以方便使用，在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间三）结核分枝杆菌抗结核药物敏感性试验实验室基本要求结核分枝杆菌药物敏感性试验要求在生物安全二级或二级以上环境中进行二、结核病实验室检查要求（一）痰标本的采集1. 痰盒统一使用螺旋盖、可密封、广口的塑料痰盒收集痰标本，参考规格：直径4厘米，高度2厘米医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号1、2、3（1为即时痰，2为夜间痰，3为次日晨痰），然后交给患者2. 标本采集（1）痰标本根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类：即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液；晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液；夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液2）痰采集方法宣教对肺结核可疑症状者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解痰标本质量对检查结果的影响，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）。

合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，标本量一般在3～5 ml3）留痰场所由于患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌的飞沫，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行4）痰标本性状干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故抗酸杆菌(AFB)的检出率较高血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞由于含血标本易干扰抗酸杆菌(AFB)镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌此类标本的AFB检出率较唾液高唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。

由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本合格的痰标本一般为干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰痰标本不合格时，应进一步指导并要求患者重新送检进行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考二）直接涂片检查1. 检查对象根据检查目的分为两类：确定诊断，发现传染源；疗效评价，作为确定化疗方案和治疗效果评价的指标1）确定诊断：凡肺结核患者、疑似肺结核患者和肺结核可疑症状者，均应进行痰涂片检查确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验2）疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰2. 涂片的制备（1）用于抗酸杆菌检查的载玻片要求① 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本② 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查③ 应使用以95％乙醇擦拭（或浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片一端的1/3处注明实验室序号及标本序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。

2）制备涂片① 小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢② 仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1 ml，于玻片正面右侧2/3处，均匀涂抹成10×20 mm的卵圆形痰膜痰膜朝上静置自然干燥后（一般约需要30分钟）进行染色镜检③ 涂抹完毕后的痰标本，在结果报告前应暂时保留④ 为了保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热3. 萋尔－尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson），简称萋尼氏染色法（Z-N）（1）试剂的配制：① 石碳酸复红染色液：碱性复红储存液：碱性复红8g加95％酒精至100 ml，充分振荡使复红溶解5％石碳酸水溶液：40-50℃水浴加热石碳酸使之融解，取5 g液态石碳酸溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100 ml石碳酸复红工作液：10 ml经定性滤纸过滤的碱性复红储存液与5％石碳酸水溶液90 ml充分振荡、混合均匀后，使用定性滤纸过滤② 5％盐酸乙醇脱色液：5 ml浓盐酸（36％）与95％乙醇95 ml混合③ 亚甲蓝复染液：储存液：0.3 g亚甲蓝溶于95％乙醇50 ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。

亚甲蓝复染液：以蒸馏水5倍稀释0.3％亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06％，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝复染液2）染色步骤：① 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10 mm 以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4次）② 滴加石碳酸复红染液，盖满玻片，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液加温时勿使染色液沸腾③ 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水④ 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止⑤ 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水⑥ 滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟⑦ 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水待玻片干燥后镜检⑧ 一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，则表明该玻片涂抹过厚4. 镜检使用10×目镜的双目显微镜读片取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100×油镜进行细致观察。

在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色；其他细菌和细胞呈蓝色为防止AFB的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜由于香柏油（cedarwood immersion oil）能够溶解复红染料，使萋尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害；故应该使用专门用于100×油镜、不干燥、不变硬且粘度适宜的镜油（immersion oil）读片时，首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推通常20 mm的痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100个视野仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过25张，且连续阅读10～12张玻片后，应休息20分钟左右5. 结果报告萋尼氏染色镜检结果分级报告标准：抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌报告抗酸杆菌菌数：1～8条抗酸杆菌/300视野抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条抗酸杆菌/100视野抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野报告1+时至少观察300个视野，报告2+时至省观察100个视野，报告3+、4+时至少观察50个视野。

6. 玻片的保存（1）萋尼氏染色玻片阅读完毕后，应及时使用擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油2）经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检3）荧光染色的玻片，玻片盒中放置干燥剂后。