AKTA蛋白纯化系统操作.doc

. AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、 AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍 AKTA蛋白纯化系统的一般操作1、认识AKTAAKTA explorer 是为方法开拓与研究应用而设计的全自动液相色谱系统该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）它们是：FIG 1、AKTA EXPLORER主机• Pump-900 为双通道高效梯度泵系列在AKTAexplorer 100，流速围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）在AKTA explore10，流速围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）• Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 围高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。

针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长围进行切换• Monitor pH/C-900，电导和pH 监测的组合监测器Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）组成部件，如混合器、柱与不同的阀安装在右边部分打开装阀的门可全部看到柱被挂在装阀的门的外侧分离装置由UNICORN 软件控制软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制2、一般操作2.1 开机按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3）Fig 3、Unicorn的操作界面2.2 准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。

2.3 清洗与管道准备首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在system control窗口点击工具栏的manual，选择 pump→pump wash explorer，选中A1,B1管道为ON， execute泵清洗将自动完毕Fig 4)Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作2.4安装层析柱在manual里选择pump→flow rate，输入一定的低流速（Fig 5），insert；选择Alarm&mon→alarm pressure，设置high alarm（输入填料或层析柱的耐受压力，以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到），insert，execute（Fig 6） 待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池Fig 5、AKTA Explorer的流速设定操作Fig 6、AKTA Explorer的限压设定操作2.5 开始纯化：1）在柱子平衡好之后（电导，pH的数值和变化趋势稳定）即开始上样了此时应将紫外调零（Fig 7），选择Alarm&mon→autozero，exectue。

Fig 7、AKTA Explorer的紫外调零操作2）具体上样方式：AKTA系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程点击pause，将A1放入样品中，点击countine，待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子3）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线在manual里选择pump→gradient，按照自己的工艺选择targetB（100％）和length（10CV）（Fig 8）Fig 8、AKTA Explorer的洗脱条件设定操作4）设定收集：选择Frac→fractionation_900,输入每管收集体积，exectue（Fig 9）完毕固定体积收集选择Frac→fractionation_stop_900，exectue（Fig 10）Fig 9、AKTA Explorer的组分收集设定操作Fig 10、AKTA Explorer的组分收集停止设定操作5）清洗泵与卸下层析柱：将A1和B1入口放入纯水中，启动pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵与整个管路。

然后再将A1和B1入口放入20％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头整个过程中应防止气泡进入6）关闭电源：从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出，其他窗口不能单独关闭然后关闭AKTA主机电源，关闭电脑电源3、程序设定操作在method editor窗口点击工具栏的method wizard，弹出窗口界面如Fig 11所示，可以分别在main selection、column以与column position三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以与所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击next按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Fig 12），在此可以设定检测的波长，针对AKTA EXPLORER可以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定A泵和B泵的溶液进口，设定好之后，点击next，出现如Fig 13所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件Fig 11 Fig 12Fig 13 Fig 14完成之后，点击next出现Fig 14的窗口，在此可以设定上样的条件，可选择的条件包括上样的方式，如上样环上样以与样品泵上样，对上样的体积也要进行设定。

如果利用系统泵上样，在此无法进行设置，不过可以利用A泵和B泵的两个进口在后面的步骤中进行设置在上步设置完成之后，点击NEXT出现如Fig 15所示窗口，这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体容可能有些差异，这里显示的界面是在安装了Frac-950收集器之后所出现的界面，设置完成点击NEXT出现如Fig 16所示的窗口，设置目标组分收集的一些参数，点击NEXT，出现如Fig 17所示的窗口，针对具体的洗脱条件可以进行设置当全部设置完成之后，点击finish，弹出Fig 18所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改，完成之后点击按钮，完成程序存盘操作至此完成洗脱程序的设定工作，在应用自动洗脱程序时，可在SYSTEM CONTROL窗口点击文件菜单栏中的FILE→Run，在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行，之后会依次弹出一些对话框，主要是再次确认程序的设置条件，并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中Fig 15 Fig 16Fig 17 Fig 184、结果的浏览与简单处理在纯化完成后，Unicorn软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如果没有指定，那么结果文件会保存于一个文件名以manual N开头的文件中，N为系统依次生成的一个1-10之间的数字。

对于结果的浏览应在evaluation窗口（Fig 19）中进行，打开文件与对文件进行普通编辑的菜单如Fig 20所示 Fig 19 Evaluation窗口Fig 20 纯化结果普通编辑菜单这里已经选择了一个纯化文件，打开后，在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择properties，可以弹出如Fig 21所示的操作菜单，可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色，设定横轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等Fig 214、AKTA蛋白纯化系统的日常维护4.1 每天，当实验完成系统使用完毕后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用 System Wash Method完成以蒸馏水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗4.2每周更换润洗缓冲液（20%乙醇）若发现储液瓶液体增多，就说明泵部有漏液，需要更换泵密封圈若发现液体减少，需要检查润洗管接头，如果没有漏液，则泵膜或密封圈需要更换。

4.3一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学与电子元件的损坏4.4 在长时间不应用系统进行试验的时候，应将系统管路充满20%的乙醇，并关闭紫外检测器，清洗PH探头，并保存于适当的缓冲液中7 / 7。