外植体的选择与培养PPT精品文档.ppt

第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养一、外植体的选择：一、外植体的选择：种质优良种质优良植株健壮植株健壮取材的最适时期取材的最适时期适宜的大小适宜的大小选材选材第第1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术1二、外植体灭菌二、外植体灭菌1：对材料进行预处理：对材料进行预处理2：材料表面灭菌：：材料表面灭菌：l1 1）水洗）水洗, ,滤纸吸干滤纸吸干; ;l2)70%2)70%酒精浸酒精浸3030～～60s;60s;l3 3）用灭菌剂处理）用灭菌剂处理; ;l4 4）用无菌水冲洗）用无菌水冲洗. .第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养2表面灭菌剂的种类较多，可选取表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度(%)持续时间持续时间（（min））去除的难易去除的难易效果效果次氯酸钙次氯酸钙9~105~30易易很好很好次氯酸钠次氯酸钠25~30易易很好很好氯化汞氯化汞0.1~12~10较难较难最好最好抗菌素抗菌素4~50mg/L30~60中中较好较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表常用灭菌剂使用浓度及效果比较表第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养3三、外植体的接种与培养三、外植体的接种与培养（一）接种（一）接种—无菌操作无菌操作l定义定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上，这一过程叫做菌培养基上，这一过程叫做接种接种。

第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养4l(1)(1)在接种前在接种前1-21-2周用周用甲醛熏蒸甲醛熏蒸接种室；接种室；l(2)(2)接种前接种前15-20min15-20min，，打开超净工作台打开超净工作台的风机以及台上的的风机以及台上的紫外灯紫外灯；；l(3)(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖鞋等；鞋等；l(4)(4)上工作台后，用上工作台后，用酒精棉球擦拭双手酒精棉球擦拭双手然后70%70%酒精喷酒精喷雾降尘雾降尘，并擦拭工作台面；，并擦拭工作台面；l(5)(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%95%酒精酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养接种前的准备工作：接种前的准备工作：5l(1)(1)对接种材料进行消毒；对接种材料进行消毒；l(2)(2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟；精火焰上方转动，灼烧数秒钟；l(3)(3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入或放在培养基表面；或放在培养基表面；l(4)(4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；l(5)(5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；走动和咳嗽等；l(6)(6)接种工具随时蘸接种工具随时蘸95%95%酒精灼烧，避免交叉污染；酒精灼烧，避免交叉污染；l(7)(7)接种完毕后要清理干净并用接种完毕后要清理干净并用70%70%酒精擦工作台。

酒精擦工作台第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养接种时的无菌操作技术：接种时的无菌操作技术：6（二）（二）  外植体培养外植体培养外植体培养：外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之指把培养材料放在培养室里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程成再生植株的过程 第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养7培养的环境条件培养的环境条件:温度温度氧气氧气湿度湿度光照光照培养室培养室培养条件培养条件第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养8定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个这个过程叫做继代培养过程叫做继代培养第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养9四、外植体成苗途径四、外植体成苗途径1、外植体、外植体→愈伤组织愈伤组织→根、芽根、芽→试管苗试管苗①①同时长芽和根同时长芽和根②②先长芽，再长根先长芽，再长根③③先长根，再长芽先长根，再长芽2、外植体、外植体→胚状体胚状体→试管苗（胚状体途径）试管苗（胚状体途径）3、外植体、外植体→根、芽根、芽→试管苗（器官发生途径）试管苗（器官发生途径）第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养10外植体外植体愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体芽、根芽、根根、芽根、芽芽芽芽芽根根根根试试管管苗苗外植体成苗途径：外植体成苗途径：第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养BAC11(1)、直接从器官上发生、直接从器官上发生(2)、从愈伤组织发生、从愈伤组织发生(3)、从游离的单细胞发生、从游离的单细胞发生(4)、从小孢子发生、从小孢子发生(1)数量多数量多(2)速度快速度快(3)结构完整结构完整第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养胚状体的产生途径：胚状体的产生途径：诱导胚状体比诱导芽的优点：诱导胚状体比诱导芽的优点：12五、培养过程中常出现的问题五、培养过程中常出现的问题                  及解决方法及解决方法第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养污染污染褐变褐变玻璃化现象玻璃化现象组织培养三大难题组织培养三大难题13第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养1、污染原因、污染原因细菌污染细菌污染真菌污染真菌污染（一）污染（一）污染真菌污染真菌污染142、污染的预防措施、污染的预防措施第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养(1)(1)减少或防止材料带菌减少或防止材料带菌(2)(2)外植体灭菌要彻底外植体灭菌要彻底(3)(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌玻璃器皿和金属器皿的灭菌(4)(4)布质制品的灭菌布质制品的灭菌(5)(5)无菌室的消毒无菌室的消毒(6)(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。

行接种151、定义：、定义：         是指外植体在培养中体内的多酚氧是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养材料的培养 第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养（二）、外植体的褐变（二）、外植体的褐变16①①植物品种植物品种             ②②生理状态生理状态③③培养基成分培养基成分  ④④培养条件不当培养条件不当 第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养2、褐变的主要原因、褐变的主要原因17①①选择合适的外植体：选择合适的外植体：  ②②合适的培养条件：合适的培养条件：  ③③连续转移连续转移  ④④加抗氧化剂：加抗氧化剂：  ⑤⑤加活性炭加活性炭第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养3、减轻褐变现象发生的措施、减轻褐变现象发生的措施18（三）玻璃化现象（三）玻璃化现象l1、定义：、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为这种现象称为玻璃化玻璃化。

第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养192、玻璃化现象产生的原因、玻璃化现象产生的原因细胞分裂素浓度较高时；细胞分裂素浓度较高时；琼脂浓度低时；琼脂浓度低时；温度低、光照时间长时；温度低、光照时间长时；气体交换不良时；气体交换不良时；培养基中无机离子种类及比例不当时培养基中无机离子种类及比例不当时第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养20①①①①适当控制培养基中无机营养成分；适当控制培养基中无机营养成分；适当控制培养基中无机营养成分；适当控制培养基中无机营养成分；②②②②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度；③③③③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素量；长素量；长素量；长素量； ④④④④增加自然光照，控制光照时间；增加自然光照，控制光照时间；增加自然光照，控制光照时间；增加自然光照，控制光照时间；⑤⑤⑤⑤降低培养温度，进行变温培养；降低培养温度，进行变温培养；降低培养温度，进行变温培养；降低培养温度，进行变温培养；⑥⑥⑥⑥增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行增加容器通风，最好进行COCOCOCO2 2 2 2施肥。

施肥第三节第三节 外植体的选择与培养外植体的选择与培养3、预防措施：、预防措施：21第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽第第1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术试管苗试管苗草莓草莓221、试管苗的生态环境：、试管苗的生态环境：    高温且恒温、高温且恒温、    高湿、高湿、    弱光、弱光、    无菌无菌一、试管苗的特点一、试管苗的特点第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽百合试管苗百合试管苗23(1)生长细弱；生长细弱；(2)光合作用差光合作用差(3)叶片气孔数目少，活性差叶片气孔数目少，活性差(4)根的吸收功能弱根的吸收功能弱(5)对逆境的适应和抵抗能力差对逆境的适应和抵抗能力差第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽小麦试管苗小麦试管苗2、特点：、特点：(与常规苗相比）与常规苗相比）24二、炼苗（驯化）二、炼苗（驯化）l驯化的目的：驯化的目的：l通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。

作用的能力，提高试管苗的移栽成活率 第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽25三、试管苗的移栽三、试管苗的移栽 l1、直接移栽法、直接移栽法l2、常规移栽法、常规移栽法l3、嫁接移栽法、嫁接移栽法第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽（一）移栽方法：（一）移栽方法：26四、提高试管苗移栽成活率的途径四、提高试管苗移栽成活率的途径1 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗、试管苗的生理状况：移栽壮苗2 2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率除细胞分裂素，有利生根，提高成活率3 3、无机盐浓度：适当降低、无机盐浓度：适当降低4 4、加入少许活性炭、加入少许活性炭5 5、控制好移栽前、控制好移栽前1010天的光、温、湿环境因子天的光、温、湿环境因子6 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡第四节、试管苗驯化与移栽第四节、试管苗驯化与移栽27本章小结：(1) 常用的培养基常用的培养基：：①①MS培养基；培养基；②②B5培养基；培养基；③③White培养基；培养基；④④N6培养基；培养基；⑤⑤KM-8P培养基。

培养基2) 水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成培养基的五种主要成分培养基的五种主要成分3) 配制母液配制母液即先配成大量元素即先配成大量元素10倍液；微量元素倍液；微量元素100倍液；铁盐倍液；铁盐100倍液；有机物倍液；有机物100倍液4) 培养基配置、分装、高压灭菌培养基配置、分装、高压灭菌(5) 筛选培养基方法筛选培养基方法，即单因子试验法、多因子试验法、，即单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法广谱实验法第第1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术28本章小结：(6) 植物培养技术植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节灭菌、接种、培养和驯化四个环节7) 灭菌与消毒的方法灭菌与消毒的方法    (8) 接种程序接种程序：：①①植物材料表面的消毒；植物材料表面的消毒；②②切割外植体；切割外植体；③③将外植体移人培养基将外植体移人培养基9)培养方法：培养方法：固体培养法和液体培养法固体培养法和液体培养法10)接种材料的培养接种材料的培养：：①①初代培养；初代培养；②②继代培养；继代培养；③③生根生根培养培养(11)试管苗驯化：试管苗驯化：注意基质、温、光、水、肥、气的综合注意基质、温、光、水、肥、气的综合管理。

管理第第1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术29第第1章章 植物组织培养实验室植物组织培养实验室构建及操作技术构建及操作技术30。