从原核表达到抗体制备.docx

一、 实验前的分析目的：得到 5mg 纯目的蛋白，并制备一抗1、载体选择pET系列：目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞 提供T7 RNA聚合酶来诱导表达，目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌 优点：•是原核蛋白表达引用最多的系统•在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低•真正的调节表达水平的“变阻器”控制• 提供各种不同融合标签和表达系统配置• 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌•许多载体以LIC载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR产物•许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列该位点结合 lac阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA聚合酶的转录（如果宿主菌DE3有pLysS或pLysE 的，亦可抑制T7RNA聚合酶的转录）除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系 统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制pET 载体表达的蛋白用途：表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、 筛选配体相互作用和抗原制备；大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备；许 多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件 组合十分适宜才可能用于大量纯化。

pET-30a-c（+） T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen（详细信息参考载体具体信息）2、 引物设计 载体一般都带有起始密码子和终止密码子，可以不另加，另外注意不要移码，还要看一 下目的蛋白含不含信号肽，看情况选择是否去掉3、 载体选择BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点二、 实验步骤1、 PCR扩增目的片段（50ul）2、 使用AxyGEN PCR清洁试剂盒清洁PCR产物（得20ul ）3、 回收产物和载体质粒分别做双酶切酶切体系为50 pL,反应体系如下：10xTango Buffer5 pL载体质粒/ PCR产物10 pL/20 pLEcoR I1.5 pLXho I(Sac I)1.5 pLdd H2O32 pLtotal50 pL37 °C酶切过夜（时间和体系跟据需要而定）4、回收酶切片段，并用T4连接酶连接目的片段和载体目的片段和载体比例一般为2:1或3:1，目的片段越长，比例越大反应体系为20 pL反应体系如下:目的片段6 pL载体质粒4 pL10xT4 DNA ligase Buffer2 pLT4 DNA ligase Buffer 1 pLddH2O 7 pL16 °C连接（3h以上）5、 转化连接产物，在抗性平板上筛选阳性克隆。

JM109感受态菌株）6、 阳性克隆提取质粒电泳检测，进行双酶切检测并测序7、 蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测挑取转化子接种于2mL离心管含1mL LB培养基（Kan+）, 37C, 250rpm, 过夜取过夜培养的菌液按1%加入两个含50mL培养基（Kan+）的PA瓶中，37C, 25rpm, 3h, OD600 ~0.6一个PA瓶中加50ul 1mmol/mL IPTG （终浓度为1 mM/L），并做标记+, 一个瓶 不加,做标记—, 30C, 250rpm, 4h各取1mL菌液离心（12000g、5min）去上清，加入30ul H2O 和15ul 3xLoading Buffer重悬菌体沸水浴10 min, 10000xg离心5 min,取上清；PBS 缓冲液：137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 10mM KH2PO4细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8, 100 mmol/L DTT, 2% SDS, 0.1%溴酚蓝，10% 甘油向100 mL LB液体培养基（kan+）中，加入1 mL携带目的基因的pET-30a 质粒的BL21 菌株，37 °C、200 rpm培养至OD600~0.7,加入IPTG （1 mmol/mL） 100 pL,在37 C条件下分别诱导0 h, 1 h, 3 h, 5 h。

分别取菌液10 mL待用SDS-PAGE电泳a） 、样品处理，取1.5 mL菌液于离心管中，10000xg离心5 min,弃上清加 入33 pL 也0和 17pL 3xLoading Buffer 重悬菌体沸水浴 10 min, 10000xg离心5 min,取上清（如果是包涵体蛋白和水溶性差的蛋白， 岂不是就检测不出来 了？？？）b） 、SDS-PAGE去（LaemmLi, 1970）,浓缩胶为4%的聚丙烯酰胺凝胶，分离胶 为12.5%的聚丙烯酰胺凝胶，上样量为30 pL在Hoefer标准垂直板电泳仪（SE600X CHROMA, Hoefer）上进行，在16 C条件下恒温电泳3 h左右，参数 设置为：5 W/Gel电泳1 h, 8 W/Gel电泳2 h直到溴酚蓝线跑至分离胶下端8 、原核表达蛋白的纯化大肠杆菌BL21在IPTG诱导下大量表达目的蛋白，由于表达的蛋白携带有His 标签，可以用康为世纪公司的6xHis-Tagged Protein Purification Kit Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒纯化主要原理是该镍柱纯化系统对6xHis-Tag蛋白具有显 著特异吸附能力。

使用之前需要检测蛋白是否为可溶性蛋白：具体步骤是通过超 声波细胞破碎仪破碎菌体（可溶性蛋白在上清中，然后通过蛋白单向电泳检测 试剂Soluble Binding Buffer 20 mM Tris-HCl （PH 7.9 ）、10 mM 咪唑、500 mM NaClSoluble Elution Buffer 20 mM Tris-HCl（PH 7.9）500 mM 咪唑、500 mM NaCl操作步骤：1） 、组装层析柱将填料上下颠倒混匀后加入层析柱，在室温条件下静置10 min,待凝胶和溶 液出现分层后，打开底部出液口，使乙醇在重力作用下缓慢流出然后向装填好 的柱内加入25 mL去离子水，将乙醇冲洗干净，再加入50 mL Binding Buffer用于 平衡柱子，平衡结束后即可上样注意保持填料湿润，平衡结束后开关闭出液 口，待上样后打开2） 、可溶性蛋白的纯化A） 、收集菌体，按每100 mg菌体（湿重）加入2 mL细菌裂解液（每1 mL裂 解液中需加入10 aLPMSF）置于冰上超声波破碎注意避免超声导致溶液过 热，可以进行短时多次超声）一、反复冻融法：1、 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2、 至少3次以上冻溶3、 IFCC推荐法：收集细胞悬液，4°C低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS （200ul），轻轻 吹打混匀，-200C冷冻30 min，370C解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液4、 用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻B） 、10000xg，4 C离心5 min，收集上清液（上清液含可溶性蛋白）上清 液需要加入等体积Binding Buffer稀释C） 、上柱，可以通过上样量控制流速，流速不宜过快，一般保持为1 mL/min （可收集部分流穿液作为对照）D） 、向柱内加入75 mL Binding Buffer溶液，冲洗除去杂蛋白E） 、使用Elution Buffer溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱液，每管1 mL, —般收 集6管F） 、洗脱后，依次加入25 mL Binding Buffer, 50 mL去离子水冲洗柱子，最 后用20%乙醇浸没填料，置于4 °C保存9、多克隆兔血清抗体制备1 、免疫动物纯种新西兰白色雄兔，体重2） 、目标蛋白分离和抗原制备采用酚抽法将蛋白浓缩，溶解于裂解液（LB）,取约5 mg蛋白量进行SDS-PAGE电 泳分离。

4C 0.25M KCI显带10 min,日光灯下观察并切下目标谱带于冰上研磨至小 颗粒后，加液氮充分研磨至粉末，并将粉末平分为三份装入1.5 ml离心管，存于-20 C备 用注射时加入同等胶粉体积的弗氏完全佐剂（Sigma, 加强注射时用弗式不完全佐剂） 并用注射器反复抽吸混合充分注射体积控制在 3 ml 左右3） 、免疫途径和方法根据田维敏等人的方法（田维敏 等， 1998），采用皮下多点注射免疫，注射部位有颈 部、背部及四肢与躯干相连接处的松软皮肤，每点注射约0.1ml注射前将注射部位及针头 用 70%医用酒精擦洗消毒，防止注射部位感染化脓购买新西兰雄兔喂养 15 天后进行第一次注射，注射 20天后加强注射一次， 7 天后自耳 静脉采血约2ml测定抗血清效价，并进行第二次加强注射，10天后于颈动脉取血，室温静 置2hr，然后于4C静置过夜收集血清，用（NH4）2SO4分级沉淀法初步纯化免疫球蛋白10、 Western Blot。