动物细胞融合最终版ppt.ppt

医学细胞生物学设计型实验实验项目:动物细胞融合2010级临床 姜俊目录• 1、实验目的 • 2、实验原理 • 3、实验步聚 • 4、实验预期结果 • 5、融合过程观察以及融合率的计算 • 6、实验试剂及材料 • 7、注意事项一、实验目的• 1、了解动物细胞的融合 • 2、熟悉PEG诱导细胞融合的方法 • 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法 • 4、培养学生自主设计实验发现问题和解决问题的 能力 • 5、提高学生的实验技能及创新能力 • 6、督促学生学习实验方法，端正实验态度，培养 良好的实验习惯一）动物细胞融合1.概念： 细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合分为细胞自发融合和诱导细胞融合诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象二、实验原理自发细胞融合（ spontaneous cell fusion) ：指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融 合现象 体内细胞的自发融合:可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细 胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。

人工合成形成的融合细胞有两类：由不同亲本 细胞融合而来由同一亲本 细胞融合而来异核体同核体2、动物细胞融合基本原理：与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性3、诱导方式物理法 ： 化学法：生物法 ：灭活的病毒电激、振动、离心电激、振动、离心聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG））例如：仙台病毒灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性 ）4.生物法 ：灭活的病毒（丧失感染性、保留抗原结构 ）过程：5、动物细胞融合技术的发展简史告诉我们 ：科学技术是不断发展的那么，实现动 物细胞融合有什么意义呢？Ø 打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；Ø 广泛应用于多个学科领域；Ø 重要用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体v细胞融合的应 用搞科研搞科研三、实验步骤• （一）、50%PEG液的制备• 根据实验需要，称取一定量的PEG（ MV=4000）放入刻度离心管内，在酒精灯焰 上加热，使其溶化，冷却至50℃时，加入 等体积病预热的无血清1640液混匀，置之 37℃水浴箱中保温待用二）、融合方法： v1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种细胞 融合）。

v2、将悬液移入离心管中，以800r/min离心7～8min，倾去上 清液，加入8～10ml Hanks液，再次悬浮细胞，离心洗涤一 次，倾去上清液后将离心管倒置与滤纸上，尽量流尽剩余液 体（这一步骤很重要，因为残留液体会改变PEG的浓度）v3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备 好的50%PEG0.4ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管 中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入8～ 10ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min 以 稀释PEG离心弃去上清液后，加入2～3ml含小牛血清的 1640培养液，在37℃水浴中孵育30min实验操作流程（一）50%PEG液的制备取一定量PEG放 入刻度离心管内在酒精灯火焰上 加热使其溶化待降至50℃时加入等体积并预热的 无血清1640液混匀置于37 ℃水浴 箱中保温待用（二）融合方法：一瓶已长成Hela细胞 或CHO细胞加入8—10ml Hanks倾去上清液， 将离心管倒置于滤纸上吸取50%PEG0.4ml常规方法消化常规方法消化制细胞悬液将悬液移入将悬液移入离心管中800r/min离心7—8min倾去上清液再次悬浮细胞离心洗涤一次手指轻弹离心管在37℃水浴中于90s内逐滴入 离心管加入7-8ml Hanks在37℃水浴中静置 5min稀释PEG 齐去上清液在37℃水浴中 卵育3min加2-3ml含小牛的1640培养液在5min 10min 20min 30min去悬液制片用0.2%次甲基蓝染色观察四、预期结果： • （一）融合过程观察： • 分别于温育5min、10min、15min、20min、 30min取细胞悬液一滴制成临时装片，以 0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察 细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程 大致分为5个阶段：细胞融合过程图五个阶段v两个细胞的膜相互接触，粘连。

v相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道v两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道v通道扩大，两细胞连成一体v细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核 的圆形细胞v （注：上述阶段可在不同时期观察）五、融合率的计算： v融合率是指在显微镜视野内，已发生融合 的细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞 （包括已融合和未融合细胞）的细胞核总数 之比对孵育30min时制备的临时装片计算 融合率通常以百分数表示，进行多个视野 测定值的平均统计更加准确融合率=（融合的细胞核数 /总细胞核数） ×100%六、实验试剂及材料• 1、材料：HeLa细胞、CHO细胞、鸡红细胞• 2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=4000）Hanks液 、0.25%胰蛋白酶、RPNI1640培养液（含10%灭 活小牛血清和不含血清的两种）、PBS、0.2% 次甲基蓝染液 • 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心机 、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管实验试剂表名称 规格用量说明聚乙二醇０.５ｍｌ使细胞膜重排Hanks液１０ｍｌ洗涤细胞０.２５％胰蛋白酶６ｍｌ使细胞分离成单个细胞RPNI1640培养液适量培养细胞PBS适量使细胞处于稳定环境.洗涤 细胞０.２％甲基蓝染液适量染色实验仪器、设备、器具表名称规格、型号 数量说明显微镜6观察细胞融合水浴箱1加热有利于细胞融合普通离心机1使细胞分离离心管2装离心液载波片21制作盖玻片盖玻片21制作盖玻片吸管4吸取细胞液试管3加热PEG洒精灯1加热PEG使其溶解七、注意事项： v1、制备的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，不然 冷却后结晶析出。

v2、在理想管中加PEG之前，一定要将离心管倒置 于滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG 的浓度v3.操作规范，防止试剂污染v4.细胞悬液的涂片制作要轻柔v5.使用离心机要注意平衡，转速从低到高Thank you ! 。