
细胞免疫荧光染色.docx
1页细胞免疫荧光染色a.将待分析的细胞传代,铺在事先放置了细胞爬片的24孔板内,细胞不宜过密,否则 会影响荧光染色观察单个细胞5000个/200ul,可以通过加到孔里粗略观察密度b•培养一段时间后,待细胞贴壁即可开始细胞免疫染c. 取上述24孔板,加入500ul含有Ca2+、Mg2+的 PBS,置于4°C摇床上摇晃3分钟, 洗去培养基和杂质,此步重复 2 次 (可常温)d. 吸取多余的PBS,每孔加入400ul 4%的多聚甲醛用于固定,4C摇床上摇晃30分钟e. 移去多聚甲醛,继续加入400ul的PBS洗去残余的液体,常温洗3次,每次3分钟f. 用PBS配制成0.1M/L氯化铵溶液,向每孔加入300ul,室温培育10分钟,用PBS洗两次,每次三分钟g. 0.5% Triton X-100 4C孵育30min,在细胞膜上穿孔,便于染色,之后用PBS洗2 次,每次 3 分钟h. TBST配制1%BSA 4C封闭1小时TBST 10X的话,用超纯水稀释i. 一抗4C封闭过夜,移去一抗,TBST洗5次,每次3分钟j. 二抗4C避光孵育1小时,移去二抗,TBST洗4次,每次3分钟,PBS洗3分钟k. DAPI核染,4C染色4分30 秒, TBST洗3 次,每次3分钟。
储存液配成10mg/ml, 200ul每管,于避光管中,-20C保存工作液为10ug/ml,用超纯水稀释,先配现 用l. 扣片,用蒸馏水洗去残留的盐分,并晾干,之后将细胞爬片缓缓从一侧放置在滴有4ul mounting media 的载玻片上(有细胞的一面向下),放在暗处晾干,用指甲油封 住圆形细胞爬片的边缘,风干即可用荧光显微镜拍片。
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