dna的重组与转座讲义.ppt

第九章 DNA的重组与转座,重组的定义 遗传重组的类型 同源重组的分子机制 重组和酶 位点特异性重组 转座 转座的机制 遗传重组的应用,6.0 重组,DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）重组的产物称为重组DNA（recombinant DNA），所有的DNA都是重组DNA由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用6.1 遗传重组的类型,根据对DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三种类型的重组其共同点是这些过程都涉及双链DNA之间的物质交换，但其发生的情况有所不同遗传重组的三种类型,（1）同源重组,,它的发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会在重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分 ⒈需要重组的蛋白质参与，eg.大肠杆菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白； ⒉蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度的影响） ⒊真核生物染色质的状态影响重组的频率。

特点：,同源重组可能发生在两条同源的DNA的任意位点,(3)异常重组,完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程eg.转座作用，需要转座酶和对转座区域DNA的复制2)位点专一性重组,重组依赖于小范围同源序列的联会，发生精确的断裂、连接，DNA分子并不对等交换 eg. λ-phage DNA对E.coli 的整合(attP→attB)，需要有15 bp的同源序列和专一性的蛋白质因子参与位点专一重组发生在两条特定的序列，两条重组DNA的其他序列则是不同的位点专一重组能使二聚体环状DNA分子产生两个单体环状DNA分子,6.2 同源重组的分子机制,同源重组（homologous recombination）发生在两个同源DNA分子之间真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换 Darlington D. C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重接，以消除张力，从而产生重组6.2.1 断裂与重接模型,First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content),Bivalent sister chromatids align with each other, this act is termed synapsis. Synapsed sister chromatids are termed a synaptonemal complex),,Figure 5-55, page 185,两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。

在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（joint molecule），也称Holliday结构（Holliday structure） 分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）1. Holliday model,Synapsed chromatids,,Recombination joint,,,Heteroduplex DNA,,,,,链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子 这需要再产生两个切口反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splice recombinant DNA)分子Holliday intermediates,,,,,,,,,,,,,,A B,A’ B’,,,,,,,,,A B’,A’ B,,Endonucleases aka. resolvases (e.g. RuvC),,Products before DNA repair,,Holliday Intermediate (see Photo in Lehninger pg 962),如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patch recombinant）。

分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA 外，均完整无缺 因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生Termed “patch recombinants”,,,两条双链体DNA分子间的重组关键是单链的交换 当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构 交换产生异源双链体DNA片断，两条单链分别来自父本和母本 联合分子可以通过切开相接的链从而形成两条分开的双链体分子DNA双链体配对,同源链被切出缺口,在双链体之间，断裂链交换,靠分叉迁移，使交叉点移动,在双链体间第二链交叉，切口被封闭,两条配对双链体DNA的重组包括相互的单链交换、分叉交换和缺口的切出Holliday模型,Holliday R.于1964年提出,旋转显示Holliday接头结构,切口控制结果,根据链被切出缺口的位置, Holliday结构的结果可产生亲本双链体或重组双链体.两种类型的产物都有一段异源双链体DNA.,Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。

DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂6.2.3 Meselson-Radding模型,Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象 1975年，Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进行了修改Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口利用切口处3’-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5’－P为末端的单链区随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D－环（D-loop）D－环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样但是更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。

DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂6.2.4 双链断裂重组模型 （model of double-strand breaks recombination）,一条染色体的两条链都发生了断裂，断裂是由内切酶水解磷酸二酯键的结果 DNA断裂之后由核酸外切酶扩大缺口, 接着是断裂链的游离3’端插入到具有完整双链的同源染色体中，形成D-环结构 在DNA聚合酶的作用下，断裂两条链分别以完整链为模板开始合成, 最后再通过断裂重接过程完成重组在受体中形成双链断裂,断裂扩大为含有3’端的间隙,3’端转到其他的双链体上,3‘端的合成替换了间隙的一条链,置换的链迁移到其他双链体上,DNA的合成发生于其他3’端,间隙被供体序列替代,相互移动产生了双交换,6.3 重组和酶,在原核生物同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点（重组热点） —— 5' GCTGGTGG 3' 3' CGACCACC 5' 在E.coli中每隔约5~10 kb有一个拷贝 Rec和Ruv蛋白参与重组RecA蛋白,RecA具有单链DNA和双链DNA的结合活性，能启动DNA单链和与之互补的双链分子进行碱基配对——催化单链取代。

RecA能促进SOS反应中的蛋白酶活性单链取代 (single-strand uptake),其中一个DNA 分子要有单链区； 其中一个DNA 分子要有游离的3'末端； 单链区和3‘末端可和另一DNA分子互补RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化这个置换反应可发生在几种不同构型的DNA分子之间，但要具备3个条件：,在双链体与单链分子之间RecA催化链交换,只要其中的一条反应链有游离端, RecA就能促进入侵的单链同化于双链体DNA中,RecA蛋白介导的DNA链交换模型,RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性 在Chi位点产生单链3’游离未端. Chi位点能够改变RecBCD的酶活性一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链但是它的解旋酶活性未受到影响 RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNARecBCD蛋白,RecBCD核酸酶从一边开始向chi位点前进, 当它前进时,它降解DNA, 在chi位点,它进行核酸内切, 而后失去RecD,并保留解旋酶活性.,RuvA可识别 Holliday的连接点结构 RuvB是ATPase，可发动迁移反应 RuvC是一种内切酶， 可特异识别Holliday分枝， 它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。

Ruv 蛋白,RuvAB是个不对称的复合体，它推进Holliday结合点的分叉迁移,损伤DNA的复制产生间隙,RecA介导链交换,第二链交换,间隙由DNA合成来填补,RuvAB介导分叉迁移,RuvC切除Holliday连接点,6. 4 位点特异性重组,位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需要RecA蛋白和单链DNA6. 4 位点特异性重组,λ噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择要进入溶原状态，游离的λ噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合（integration）由溶原生长进入裂解生长，λDNA又必须从宿主染色体上切除下来，这个过程称为外切（excision） 整合和外切 均需要通过细菌DNA和λDNA特定位点之间的重组来实现，这些位点称为att位点（attachment site） λ噬菌体的int编码整和酶来催化整和反应位点专一性重组的核苷酸序列,1. POP’: O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列； P为-160 ~ 0的160bp序列 P’为0 ~ 80的80bp序列 2. BOB’: B为-11 ~0序列 B’为0 ~11序列,λ噬菌体的整合和切除,,,共240bp,共23bp,通过在attB和attP之间的相互重组，噬菌体环状DNA转变成线性的前噬菌体；而通过在attL和attR之间的相互重组，前噬菌体能被外切出来。

λ-DNA对E.coli的整合： POP’ + BOB’ →BOP’—POB’ 需要整合酶(Int—拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与 λ-DNA从。