分子生物学+染色体与dna—.ppt

第2章 染色体与DNA 第一节 遗传的基本单位——基因 第二节 原核生物基因的结构特点 第三节 真核生物基因的结构特点 第四节 DNA复制 第五节 DNA的损伤与修复 第六节 DNA的转座 v 复制（replication）：遗传信息从亲代DNA 传递给子代DNA的过程，称为复制 一、 DNA复制的基本特点 二、 DNA复制的几种主要形式 三、 原核生物DNA的复制特点 四、 真核生物 DNA的复制特点 五、 DNA复制的调控 第四节 DNA的复制 l半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity) l双向复制(bidirectional replication) l半不连续复制(semi-discontinuous replication) 一、DNA复制的基本特点（一般特征） u DNA半保留复制 v 概念：当细胞分裂DNA进行复制时，双螺旋结 构解开而成为两股单链，并各自作为模板，用以 指导子代合成新的互补链这样在子代细胞出现 新的DNA双链中，其一股单链从亲代完整地接受 过来，另一股单链则是完全重新合成的，且与母 链按碱基配对原则互补。

也就是说两个子细胞的 DNA双链，都和亲代母链DNA碱基序列完全一致 ，这种复制方式称为半保留复制（ semiconservative replication) DNA半保留复制的证据 含15N-DNA 的细菌 第一代 培养于普 通培养液 第二代 培养于普 通培养液 普通DNA 的沉降位置 普通DNA 重DNA 重DNA 密度梯度 离心结果 15N- DNA14N- DNA 半保留复制的意义 § 通过半保留复制，子代保留了亲代DNA的全部遗 传信息 § DNA分子中的遗传信息通过转录和翻译（基因表 达）决定细胞的蛋白质结构和功能，即DNA通过复制 和基因表达决定了生物的特性和类型，从而体现了遗 传过程的相对保守性 § 遗传信息的相对稳定，是物种稳定性的分子基础 ※ 在强调遗传恒定性的同时，不能忽视 其变异性 A T G C A T A T C G T A T A A T G C A T A T C G T A T A A T G C A T A T C G T A T A 通过半保留复制，子代和亲代DNA完全一致 从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫 复制子 复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形 成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故 称为复制叉 u 复制的起点、方向和速度 • 领头链(leading strand)：顺着解链方向连续复制的链。

• 随从链(lagging strand)：与解链方向相反不连续复制 的链 5´ 5´ 5 5 5´ 3´ 3´ 3´ 领头链 随从链 解链方向 复制方向与解链方向关系 复制叉 DNA的半不连续复制 u 双向复制与半不连续复制 复制叉 复制叉 复制方向和速度：复制方向和速度： 单起点、双向等速 多起点、双向等速 二、DNA复制的几种主要形式 1、θ型复制 大肠杆菌DNA在复制时可形成类似希腊字母θ形状 （一）线性DNA双链的复制 （二）环状DNA双链的复制 3´-OH 5´-P 3´-OH 5´-P 2、滚环复制 第一阶段：以亲本单链（＋）为模板，合成 互补链（－），形成闭合的双链环状复制形 第二阶段：滚环复制一个负链可以合成许多 正链，正链用于噬菌体包装 是单向复制的特殊方式 如：ΦΧ174的双链环状DNA复制型（RF） （1）模板链和新 合成的链分开; （2）不需RNA引物 ，在正链3‘－OH 上延伸 （3）只有一个复 制叉; dNTP DNA-pol γ 3、D环复制: 也单向复制的一种特殊方式 首先在动物线粒体DNA的复制中被发现 （一）DNA双链的解旋 1、DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)： 简称拓扑酶Topo. • 种类：分Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型。

• 作用：改变DNA分子的拓扑构象，使DNA超 螺旋结构松弛，克服打结，配合复制 三、原核生物DNA的复制特点 解链过程中正超螺旋的形成 Ø 拓扑异构酶Ⅰ型的作用特点 ： ⑴大肠杆菌中的TopoⅠ主要是松弛负超螺旋，而 对正超螺旋无作用，故在复制叉的行进中不起作 用；但真核生物的TopoⅠ对负超螺旋及正超螺旋 均有作用 ⑵切断DNA双链中的一股；TopoⅠ对单链DNA 的亲 和力比双链高得多，这是它识别负超螺旋DNA的分 子基础 ⑶互补链通过缺口，适当时候又把切口封闭； ⑷不消耗ATP 拓 扑 异 构 酶 Ⅰ 的 作 用 Ø 拓扑异构酶Ⅱ型的作用特点： ⑴在无ATP时，切断DNA双链的两股，未断的DNA双链 穿过缺口，在ATP供能时将切口封闭 ⑵在模板的复制起始点附近使DNA引入负超螺旋，这 对于复制的引发是必要的 ⑶在复制延长过程中，TopoⅡ可松弛复制叉前方的 正超螺旋，以利于复制叉的行进 ⑷复制末期，处理母链与新链的打结 2、DNA解链酶(DNA helicase): 解链酶有多种，包括大肠杆菌解链酶Ⅱ、Ⅲ、 DnaB蛋白或Rep蛋白等它们在起始点上结合并打 开DNA双链，此过程消耗ATP。

解链酶多延随从链以5′→3 ′方向移动，只有 Rep蛋白延前导链以3′→ 5′方向移动 DnaA蛋白辨认复制起始点，DnaC蛋白辅助 解链酶 3、单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) SSB也称螺旋反稳定蛋白(helix destablizing protein, HDP) v 其作用是在复制中维持模板处于单链状态，并 保持单链的完整 v 大肠杆菌的SSB是由19KD亚基构成的四聚体，对 单链DNA亲和力强 l 解开的双链分别与SSB结合，结合范围8-16个核 苷酸 SSB对单链DNA的亲和力强，而对双链DNA 及RNA的亲和力弱 l 原核生物中，SSB与DNA的结合表现出协同效应 原核生物DNA只有一个复制起始点，称Ori C (origin C)大肠杆菌DNA复制起始时，Dna A 辨认并结合Ori C，而且Dna A只与处于负超螺旋 状态下的DNA相结合 • 复制起始时，模板起始部位DNA负超螺旋构象 的形成，主要由TopoⅡ引入 • DNA复制必须以单链为模板，大肠杆菌解链酶 分解ATP获得能量，将双链解开 （二）DNA复制的引发 E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 1 13 17 29 32 44 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列 5 3 5 3 u 复制起始点 双链解开、复制起始双链解开、复制起始 大约20个DnaA 蛋白在ATP的 作用下与oriC 处的4个9bp保 守序列相结合 在HU蛋白和ATP的共 同作用下,Dna复制起始 复合物使3个13bp串联联 重复序列变性,形成开链 解链酶六体分 别与单链DNA 相结合(需 DnaC帮助),进 一步解开DNA 双链 u 引发前体的生成： 引发前体(preprimosome)包含有多种蛋白质因子， 其中至少包括Dna A、 Dna B、Dna C。

v 复制起始时Dna A的作用： ① Dna A辨认并结合Ori C中的四个9mer，形成 20-30亚基的起始复合物 ② Dna A促使Ori C中的三个富含AT的13mer局部发 生解链，形成解链复合物，此过程有ATP参与 ③ Dna A引导Dna B·Dna C复合物进入局部解链区， 形成引发前体复合物，之后Dna B发挥解链酶的 作用，继续解链 u 引物（primer）的合成： • 引物酶 复制是在一段RNA引物的基础上进行的， 催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同 于催化转录过程的RNA聚合酶，故称为引物酶 (primase) 大肠杆菌的引物酶又称为DnaG蛋白，是一条 60KD的多肽链引物酶在模板复制起始部位催 化互补碱基聚合，形成短片段的RNA • 引发体 DnaA、DnaB、dnaC蛋白，还有其他 复制因子一起形成复合体，结合到模板DNA分子上， 再结合引物酶(DnaG)，形成较大的聚合体，这种复 合物称为引发体 引发体下游解开双链，再由引物酶催化引物合成 不同生物RNA引物及结构不同，动物细胞RNA 引物约由10个核苷酸组成，第一个核苷酸常为ATP， 原核生物RNA引物由数十个核苷酸组成，第一个核 苷酸常为GTP 。

v 复制的起始 ⑴ DNA拓扑异构酶Ⅱ在复制起始部位将DNA引入 负超螺旋 ⑵ DnaA蛋白辨认、结合于起始位点的9mer处，并 促使13mer局部解链 ⑶ DnaB与DnaC复合物进入，生成引发前体，然后 DnaB继续发挥解链的作用 ⑷ SSB与解开的单链结合，稳定和保护单链 ⑸ 引物酶(DnaG)进入并与引发前体结合生成引发 体 ⑹ 引发体中的引物酶催化NTP聚合，生成引物 ⑺ DNA拓扑异构酶(Ⅱ型为主)在解链前方理顺DNA 链，松弛正超螺旋 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓扑异构酶 引物 酶 SSB 3 5 3 5 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体 • 前导链(leading strand)：顺着解链方向连续复制的链 • 后随链(lagging strand)：与解链方向相反不连续复制的链 • 冈崎片段(Okazaki fragment): 随从链上不连续复制的片段 称为冈崎片段 5´ 5´ 5 5 5´ 3´ 3´ 3´ 领头链 随从链 解链方向 复制方向与解链方向关系 复制叉 DNA的半不连续复制 （三）冈崎片段与半不连续复制--链的延伸 （四）复制的终止 v 基因组中能独立进行复制的单位称为 复制子(replicon)， 每个复制子中含有一个复制起始点和一个 复制终止点。

原核生物染色体只有一个复制起始点，故 有单一的复制子； • 原核生物基因是环状DNA，双向复制的 复制片段在复制的终止点(ter)处汇合 oriC ter 100/0 32 82 oriC ter 猿猴病毒 SV40复制的 起点和终点 180o E.coli复制的 起点和终点 双链环状、θ型复制、双向等速 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ OHP polⅠ5´→3´外切酶 polⅠ5´→3´聚合酶 dNTP 连接酶 ATP ADP＋Pi u不连续片段 的连接 DNA连接酶应用： ⑴在复制中起最后接合缺口的作用 ⑵在DNA修复、重组、剪接中也起缝和缺口的作用 ⑶基因工程的重要工具酶之一 （五）原核生物的DNA聚合酶 u 种类： 大肠杆菌中存在DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ ⑴ DNA聚合酶活性： 三种酶都有DNA聚合酶活性，且都需要 模板和引物，但DNApolⅢ对底物的亲和 力最高，聚合方向为5´→3´ ⑵ 3´→5´外切酶活性： 三种酶都有，但DNApol Ⅰ活性最强 这种酶活性是基于对不配对碱基造成 的单链的识别，故对复制的保真性至 关重要。

v DNApol 。