病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究进展.doc

1病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究进展病毒是目前所知最简单的生命单位，只有核酸和蛋白质组成病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究对病毒复制、病毒病防治和阐明生命活动的基本规律具有重要意义分子病毒学的研究成果促进了病毒衣壳装配和核酸包装机制的研究，近几年有关病毒装配和核酸的包装机制研究取得了较大的进展本文就病毒衣壳的装配途径、装配原理、核酸包装机制和包装信号序列等综述如下 1　病毒衣壳装配途径 病毒颗粒主要由核酸和蛋白质组成，核心为病毒基因组，为病毒增殖和遗传变异提供遗传信息衣壳可保护病毒核酸免受外界因素影响破坏，并可介导病毒核酸进入细胞内部，衣壳是病毒的主要抗原成份，是研制病毒蛋白疫苗的主要靶位病毒衣壳是由病毒结构蛋白装配形成的，病毒主要衣壳蛋白具有自身装配成病毒样颗粒的特性(virus-like particle, VLP)，即无有核酸的病毒空衣壳有些病毒可能还需病毒编码的骨架蛋白(scaffolding protein)辅助，这些病毒衣壳被称为原头(prohead) 、原壳 (procapsid)或病毒样颗粒(Virus-like particle, VLP)［1］ 噬菌体衣壳装配首先由 12 个孔2道蛋白 gpI 聚合成玫瑰形的十二聚体顶角，此顶角为病毒核酸包装和感染细菌过程中核酸出入的通道［2］ 。

在疱疹病毒感染的细胞内有三种衣壳：A 型衣壳为一空壳，不含病毒核酸及内部结构；B 型衣壳又称中间型衣壳，不含病毒核酸，但在病毒外壳内还有一蛋白质层；C 型颗粒为完整的病毒颗粒B 型衣壳是 A、C 型的前体，B型衣壳的蛋白质层为骨架蛋白，由 VP21、VP22a 组成，在 A 型和C 型中消失病毒衣壳中主要衣壳蛋白 VP5 约占 70%，其余衣壳蛋白 VP19c、VP23、VP26 约占 30%，仅有这 4 种衣壳蛋白还不能形成病毒衣壳，只能形成异型多聚体只有在骨架蛋白辅助下方可形成 HSV B 型衣壳HSV 病毒衣壳装配可分为以下几步：(1) 病毒主要衣壳蛋白(VP5)与蛋白酶(VP24)前-VP21 及前-VP22a 共价形成小分子复合物，在附件蛋白(VP19c、VP23)辅助下逐渐形成部分衣壳和完整的 B 型衣壳VP5 形成 HSV-1 的衣壳主要部分，前 -VP21 和前 VP22a 为骨架蛋白，形成衣壳内部蛋白质层蛋白酶VP24 在两层之间发挥桥梁作用2)VP24 水解前-VP21 和前-VP22a，改变了骨架蛋白的形态与结构， VP24 与前-VP21 分离而与 VP5 共价结合附着在衣壳上面，VP21 与 VP22a 形成缩小的骨架蛋白层。

3)HSV DNA 通过末知机制进入 B 型衣壳伴随VP21、VP22a 出壳，衣壳蛋白构象变化、结构亚基重排形成为成熟 C 型颗粒如果病毒 DNA 包装失败，骨架蛋白出壳或降解，而VP24 与 VP5 共价连接形成 A 型衣壳HSV 衣壳经 GuHcl 处理后，病毒 DNA 以细条带形式从衣壳顶角处出壳［3］ 因此认为 HSV 衣3壳五邻体顶角为病毒 DNA 出入衣壳的位置，GuCl 处理导致五邻体短暂开放，DNA 出壳后再恢复原始状态［4］ 2　病毒衣壳装配的几何原理 60 年代初，Kaspar 和 Klug 等提出用准等构理论(theory of quasiequivalence)解释大量病毒蛋白亚基组成球状病毒 20 面体立体对称结构的机理根据这一理论，所有结构蛋白亚基在组成球状壳体的排列，并不严格按照球状所要求的严格等构方式，而是由亚基之间连接发生一些畸变，从而导致了轻微的不对称，这样大量结构蛋白亚基只有根据 20 面体立体对称，形成一个等距球体衣壳应有 20 个面，12 个顶角，30 条边，且有 5、3、2 三种对称轴，蛋白亚基具有相同的构象，衣壳由五邻体和六邻体构成，只能有 12个五邻体，六邻体的数目为 10 的倍数［6］ 。

然而还有一些病毒为非准等构理论结构，如乳多空病毒衣壳由 72 个壳粒组成，全部为五邻体，其中有 12 个五价五邻体和 60 个六价五邻体电镜研究表明病毒结构蛋白可存在几种不同的构象，如 P22 噬菌体衣壳蛋白gp5 有 7 种构象、SV40 的 VP1 共有六种构象因而 Berger 等于1993 年提出局部法则理论［7］(local rule-based theory)认为病毒结构蛋白亚基可具有几种不同构象，蛋白亚基构象间的特异识别4及聚合形成病毒衣壳装配的动力，进而形成一个闭合的衣壳若在蛋白亚基装配过程中有一次构象识别错误，则导致衣壳形成不能闭合的螺旋状结构病毒的空心衣壳与成熟的病毒颗粒衣壳结构还有一些显著差别 病毒空心衣壳结构疏松，沿衣壳的 5、3、2 对称轴上有贯穿衣壳的裂孔当病毒 DNA 包装完成以后，病毒衣壳变得致密，裂孔关闭，至少在衣壳内 2/3 处关闭伴随病毒核酸包装，病毒衣壳膨胀，衣壳蛋白构象可发生变化［8］ 如噬菌体 HK97 为20 面体立体对称结构，衣壳由 415 主要结构蛋白构成，衣壳蛋白亚基分子量为 42KDa，无骨架蛋白，在病毒衣壳装配过程中可出现4 种衣壳演变形成：①proheadⅠ ：由 415 个 42KDa 的结构蛋白亚基构成，衣壳蛋白之间无酶解、共价交联和构象变化，易被离解为多个壳粒。

②proheadⅡ：衣壳大小不变，由于衣壳蛋白氨基端被水解而变为 31KDa，所以衣壳内层密度变弱 ③HeadⅠ：病毒核包装，衣壳膨胀，厚度变小，成为多角体，壳粒结构发生明显变化，各结构蛋白亚基之间发生交联④HeadⅡ：酶解后的 31KDa衣壳蛋白亚基之间以共价键交联，形成 5、 6 个或多个蛋白亚基形成的寡聚体，衣壳蛋白构象发生变化，各亚基之间重排形成牢固的20 面体立体对称结构 3　病毒核酸包装机制 5病毒核酸包装可能有两种包装机制，一种以乳多空病毒为代表，病毒基组与细胞组蛋白首先形成微型染色体，然后病毒结构蛋白以病毒微型染色体为支架，不同构象的蛋白亚基之间特异识别与聚体逐渐装配形成封闭的病毒颗粒，核酸包埋其中，似“作茧自缚” 但在无病毒 DNA 时，衣壳蛋白仍可装配病毒样颗粒(VLP)，表明病毒衣壳装配是不必依赖于其 DNA 为支架的［9］ 另一种以噬菌体、腺病毒、疱疹病毒为代表，其机制为病毒结构蛋白在细胞内预先形成衣壳，然后病毒 DNA 被特异识别并包装进入衣壳，形成完整的病毒颗粒这类病毒 DNA 复制时，病毒基因组可从多个复制起始点开始，一个复制周期完成之前，下一个复制周期已开始形成基因组首尾相接的串联体(Concatamer)，病毒以串联体为底物，由病毒编码的包装酶(package enzyme)或未端酶(Terminase) 将病毒基因组从串联体上包装起始点特异切割(首次切割)，当一个单位的病毒基因组从孔道蛋白或五邻体进入并充满衣壳后，由 Head 机制启动末端切割，从而完成病毒 DNA 包装。

而某些病毒 DNA 复制结束后，就形成一个完整的基因组，如腺病毒 DNA5′端共价连接 DNA 结合蛋白 TBP，在包装过程中不需对 DNA 切割［10］ 病毒包装酶是由病毒基因编码，分为大小两个亚基，大亚基可特异结合病毒衣壳顶角处的孔道蛋白、金属离子及 ATP小亚基6可特异识别与结合病毒核酸及 ATP包装酶都具有保守的 ATP 结合框架，因而具有 ATP 酶活性在 DNA 包装过程中，每包装两个碱基对则需消耗一个 ATP依据包装酶对 DNA 切割的特异性不同又可分为三种类型：第一类为特异的首末次切割，因而病毒衣壳中核酸具有相同的长度，如 SV40、T3、T7 噬菌体第二类为在病毒DNA 特定区域发生非序列特异性切割，如 T1、P2、P22、SPP 噬菌体，病毒衣壳中核酸长度有轻微差异第三类为完全非特异性切割，如 T-even, 因而衣壳中的核酸是随机的［11 ］ 最近研究发现噬菌体 Φ29 包装机制与其它噬菌体又有不同：在其 DNA 包装过程中还需一病毒 DNA5′端编码的一小段 RNA 被称为包装 RNA(pRNA)pRNA5′和 3′端在 DNA 包装过程中发挥关键作用［12］ 。

pRNA 一端可结合于 P22 孔道蛋白上，另一端则以短暂互补方式结合于病毒基因组 5′端病毒核酸进入衣壳的方式有以下几种学说：包装酶与孔道蛋白形成渗透压泵模型、可转动螺纹模型、捕捉臂模型、搬手模型等病毒 DNA 进入衣壳后其体积将是包装前的 1/30～1% 4　病毒基因组包装的信号序列 病毒核酸包装是一个复杂的过程，是蛋白质与蛋白质及蛋白质与核酸之间的复杂作用引起的病毒结构蛋白或病毒包装酶识别7病毒核酸，并从细胞大量 DNA 中特异选择包装病毒 DNA，其机制目前尚不十分清楚但大量研究表明在病毒基因组上游调节区或编码包装酶的基因中有一核酸包装信号序列，称为包装序列(Pac 序列)某些病毒 pac 序列包括包装酶特异识别与切割两个部分包装序列可与包装酶或衣壳结构蛋白发生特异识别目前研究较为深入的有噬菌体、腺病毒、疱疹病毒、SV40 等噬菌体 pac 包装序列包括三部分，cosN 、cosQ、cosB包装酶 gpA、gpNUI 可在串联体上 cosN 位点处特异切割形成粘末端，cosN 为包装酶特异切割位点，cosB 为包装酶特异识别结合点位，cosQ 为基因组包装完成以后末端切割位点只有包装酶在 N1 和 N2 两点切割形成 12 个碱基末端方可被特异包装。

其它切割形式因不稳定而降解［13］ 腺病毒包装信号序列位于反向重复序列 ITR 与 EIA 之间的 230～380 核苷酸内，有一系列 AT 重复序列组成，至少需 3 个 AT 重复序列参与DNA 包装 SV40 的包装信号序列为位于 SV40 DNA 复制起始位点 ori 附近的六个 GC 盒组成的 ses 结构 GC 盒数目、位置及与ori 距离都可影响 SV40 包装效率SV40 衣壳还可选择性包装SV40 ses 结构携带的外源基因，并将外源基因导入 SV40 敏感的靶细胞核内［14］ HBV 病毒复制具有逆转录病毒特性，HBV 转录的前基因组 Pg RNA 被 HBV 衣壳蛋白选择包装主要是由 Pg RNA 近5′端一段顺式元件介导的，称为 E 元件E 元件决定 Pg RNA 被特异选择包装HBV 衣壳蛋白可特异包装 E 元件所携带的一大段外源基因由于 pac 元件由大量重复序列组成且包含很多顺式反应元件，8那么 pac 元件所形成的二级结构及其相应的反式作用因子对病毒核酸包装的影响目前尚不清楚病毒装配机制的研究对病毒性疾病的防治具有重要意义由于病毒衣壳可特异包装 pac 元件所携带外源基因，人们可借助病毒的组织亲嗜性，用衣壳蛋白将目的基因特异包装并运送到特异靶细胞，可为人类基因治疗提供理想的载体。

由于病毒结构蛋白亚基上有病毒装配的非关键区域，可将外源表位上插入此处，而不影响病毒颗粒装配，人们可借助此开发携带多种外源基因的嵌合病毒样颗粒疫苗 参考文献 1　Newcomb WW, Homa FL, Thomson DR, et al. Assembly of Hepes simplex virus capsid: characterization of intermediate observed during cell-free capsid formation. J Mol Biol, 1996; 263:432-446. 2　Prasad BVV, Prevelige PE, Maritta E, et al. Three-9dimensional transformation of capsids associated with genome packaging in a bacteriophage. J Mol Biol, 1993; 2。