实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法%3f.ppt

氨基酸的分离鉴定——纸层析法生物化学实验之一生物化学实验之一安徽师范大学生科院生化教研室一、实验目的1. 掌握纸上层析的一般原理和方法2. 了解氨基酸的特征性颜色反应二、实验原理l纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析滤纸纤维上的羟基具 有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相当有机 相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离 l溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Yl在一定的条件下某种物质的Rf值是常数 Rf值的大小与物质的 结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 本实验利用纸层析法分离氨基酸 三、实验器材（1）层析缸 （2）毛细管：5只/组 （3）培养皿：1只/组 （4）层析滤纸（长16cm、宽16cm的） ：1张/组 （5）直尺、铅笔：自备 （6）电吹风：1只/组 （7）针、白线：1套/组 （8）小试管：4只/组 四、实验试剂1. 展层剂和平衡液正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展 层剂；下层液作平衡液(弃去)2. 样品液用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶 液，以及上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。

3. 茚三酮按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解 实验试剂 五、实验操作l检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净 并置于干燥箱内120℃烘干 （2）规划：取宽约16cm、高约 16cm的层析滤纸一张在纸 的下端距边缘2cm处轻轻用铅 笔划一条平行于底边的直线A ，在直线上做4个记号，记号 之间间隔2cm，这就是原点的 位置另在距左边缘1cm处画 一条平行于左边缘的直线B， 在B线上以A、B两线的交点为 原点标明刻度（以厘米为单 位），参见左图3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M)，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次前三种氨基酸各点3次，混合液点6次将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙 （4）层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅速放置于层析缸中把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点当溶剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿l（5）显色：热风吹干滤纸 至显出氨基酸斑点，用铅 笔描出轮廓参见左图l（6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中 都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实 验报告上，见表3-2。

l（7）倒掉用过的展层液，将培养皿洗净，整理好 桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台 ，请老师验收，实验报告当场交给老师l（8）计算 Rf纸层析结果丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 待测氨基酸 原点到层析斑点 中心的距离 原点到溶剂前沿 的距离 Rf判断待测氨基酸 思考题1、氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这种 显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色?写出 这种显色剂与氨基酸反应的反应式 2. 何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么?。