动物细胞融合-实验报告1300字.docx

    动物细胞融合实验报告1300字    实验二：动物细胞融合一、实验目的1、了解动物细胞融合的常用方法——聚乙二醇诱导细胞融合的基本原理2、学习化学融合的基本操作过程二、实验用品1、材料鸡血红细胞2、试剂50%PEG、Hank’s溶液（pH7.4）、Alsever’s细胞保存液0.85%氯化钠溶液3、器材普通光学显微镜、离心机、量筒、载玻片、盖玻片离心管、废液缸等三、实验原理细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合1、病毒诱导融和仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合用紫外线灭活后，这些病毒即可 诱导细胞发生融合2、化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。

化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性PEG是广泛使用的化学融合剂3、电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点PEG，又名聚乙二醇，是目前应用做多的一种化学促溶剂其优点是使用方便，活动稳定，容易制备和控制四、实验步骤1、鸡血细胞的制备与保存2、取鸡血1ml+0.85%的NaCl溶液4ml，在1000r/min的离心机内离心5分钟3、将上一步的沉降血球（去上清液后，约0.1-0.2ml），加入GKN液至4ml，制成细胞悬液4、取细胞悬液1ml稀释到10倍，共10ml5、取上步得到的细胞悬液1ml，加0.5ml的PEG液，静置5min后摇匀6、吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入Janus green染液，用牙签搅匀，染色3min后用滴管滴到盖有盖玻片的血细胞计数板，在显微镜下观察并计数五、实验结果计数结果：右上角：14个细胞核，6个融合右下角：20个细胞核，8个融合左上角：13个细胞核，7个融合左下角：10个细胞核，6个融合中间格：17个细胞核，8个融合融合率=47.3%六、 结果分析及讨论1、实验速度较慢，鸡血细胞失去活性。

2、结果中由于PEG的作用，细胞变形情况较为严重3、离心速度较小，时间较短使细胞融合不充分4、、因为PEG有的凝集作用，红细胞发生多细胞的凝集反应5、、因融合时间短的缘故，没有观察到细胞的完全融合第二篇：动物细胞培养助教总结报告 9800字动物细胞培养助教总结报告李 骥 3009213008一、实验目的1、了解动物细胞培养的概念与分类2、熟悉无菌操作的步骤以及技巧二、实验原理1.动物细胞培养 animal cell culture动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖2.原代培养 primary culture原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养3.传代培养 subculture当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养这个过程就称为传代或者再培养对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段4.培养基 Medium培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定5.无菌操作接种是细胞培养中极其重要的一环接种过程是一个严格的无菌操作过程，操作不慎很容易引起污染接种通常在超净工作台内进行，由于空气的高效过滤和一定的气流速度吹动，工作台面上能保持一完全无菌的环境如没有超净工作台，可在接种箱内进行三、仪器和药品仪器：酒精灯，培养皿x2x，手术剪，手术镊x2，漏斗，玻璃离心管，培养瓶，胶头滴管x2，一次性注射器，烧杯x2，37℃恒温箱，离心机试剂：DMEM细胞培养液（pH约为7.4），DMEM细胞培养液（含血清），胰蛋白酶*DMEM细胞培养液DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。

高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等四、实验步骤1、剪碎从鸡蛋内取出鸡胚，在培养皿中去掉头和四肢，将躯体剪成3-4块，用不含血清的培养液清洗，然后转移至另一个培养皿，剪碎至1mm2的小块，再清洗，转移至玻璃离心管2、离心将剪碎的组织和无血清培养液加入玻璃离心管后，用相同的离心管装入自来水进行质量配平，供离心用配平标准为天平的指针稳定在标盘某刻度，并非必须要在正中间此次离心时间约为3分钟，速度为2000/min 左右3、消化离心后，倒出上层清夜（无菌操作）加入胰蛋白酶约5ml，在37度恒温箱内进行消化消化时长约为15min，每5分钟振摇一次，发现试管内组织微微泛白，即可停止，然后直接进行离心3000/min,3mins4、过滤装瓶离心后，弃去上层清夜（可留部分），加入2-3ml含血清的培养液，吹打，后加入含血清培养液至5-6ml，进行过滤（无菌操作）贴标签，恒温培养五、预实验情况1、熟悉实验具体内容我组提前两周进入实验室进行预实验，在李老师简单介绍并进行了操作演示后我们开始查阅资料，了解细胞培养的具体步骤，操作方法，以及所需的仪器和药品，并开始着手配制培养基和准备仪器。

2、实验前准备卖鸡蛋，送恒温箱保存；清洗仪器(离心管，剪刀镊子等)，10遍自来水洗，后5遍蒸馏水洗→烘干→高温高压灭菌(蒸)1h左右→超净台紫外线照射20min→开始实验3、遇到的问题(1)配液时胰蛋白酶不溶解决过程：①咨询学长学姐，发现超声助溶效果并不好②我们尝试搅拌子搅拌助溶，经过一夜的搅拌，出现白色絮状沉积，振摇后散开，没有溶解③咨询李老师后尝试缓慢加入胰蛋白酶粉末，溶解效果有所提高，但胰蛋白酶的活性很不好最终解决办法：李老师直接购买了液体胰蛋白酶，方便实用且活性很好 这个故事告诉我们，光花钱是做不好实验的，但是不花钱更是做不好实验的2)培养基问题培养基在配置前是粉末状的，第一次使用的培养基是含酚红的1640，但由于量不够，又补充了一些不含酚红的1640最后培养基的颜色成橘红色而第二次配液时，1640已全部用完，我组改用不含酚红的DMEM培养基鉴于二班组按照理论值加入酚红后培养基过红影响观察，且考虑到酚红是用来鉴别酸碱性的，定性不定量，所以我组酚红并未定量加入，而是采取边观察边加入的方法，保证培养基成色最好3)消化时长预实验时发现用胰蛋白酶消化组织并离心后剩余的液体常成鼻涕状，不易分离上清液。

查找资料后得知，这是消化过度造成的影响而后我组在做实验时，精确控制消化时长，静置为15分钟，开摇床为10分钟并同时目视监控，一旦发现组织已泛白即停止消化，保证后续操作的顺利进行效果较好PS：在后期的实验中，我发现胰蛋白酶的活性随着购买时间的增长有明显的降低，所以对胰蛋白酶的活性的探究应该注明购买时长4)关于吹打的操作由于开始做实验时很多操作很不熟悉，吹打时多使用灭菌枪头但后来发现用灭菌枪头的两个弊端①吸培养液时，培养液容易因吸取过快或倾斜枪体而接触枪口导致污染②枪头嘴太小，无法吸入组织块，吹打很不顺利因此我们分两次改进了仪器，第一次将1000μL的枪改为5000μL的枪，并用剪刀剪去枪头尖端，使枪嘴粗大，保证在不出现错误操作的前提下不会有污染的发生第二次将无菌枪头彻底改为带棉塞的胶头滴管，效果较好胶头滴管灭菌彻底，吸收顺畅，便于吹打唯一的缺点就是准备时较麻烦，且使用时要先上胶头，对操作者要求较高4、录制视频我和小丽分别录制了实验操作全过程的视频，但是后来因为觉得视频太过抽象，而且印象不深，没有重点，经商议，我们决定现场演示5、预实验总结预实验阶段共买蛋1次，配制培养基2次，取鸡胚4只每次实验均可以成功地观察到细胞贴壁现象，其中，最后一次实验由高晓丽同学观察到了组织块贴壁生长的现象，并以此来对大家进行要求（后来证明其实并不是组织块贴壁）。

六、带实验情况1、实验前准备买蛋（感谢李老师），灌装酒精灯12个，清洗并灭菌仪器12套，配制充足培养基并过滤，倒置相差显微镜的连接，实验当天早晨紫外杀菌2、实验时情况情况众多，比较顺利由于条件限制，我们的操作环境无法保证绝对无菌，不过因为培养基中加入了双抗的缘故，在整个实验中如果没有重大的操作失误是很难长菌的但是由于小鸡出壳的画面比较限制级，还是有很多女生没有忍住发出了“啊”和“呃”一类的呼喊，其实在无菌操作的时候是不允许说话的…另外因为所有人都是第一次接触活体动物实验，而且主刀的大部分是男生，力气比较大，又有些激动…导致有些鸡胚在还没有出壳时就被分尸了，之后出壳过程花了很长时间空气中暴露时间越长，就越容易染菌，还望大家以后注意 这个故事告诉我们，人生无论遇到什么事情，都要保证内心的平静，安详，与矜持3、实验结果观察由于我和小丽是一步一步带着大家做的，所以除了极个别组出现了一些小问题外，大部分组的细胞都顺利贴壁，且长势良好然而绝大部分组的组织块体积都过大，很少有人按要求剪碎至1mm?后放入培养瓶导致观察时出现了大片的阴影，很难寻找细胞不过我还是顺利帮大家找到了组织块爬出来的细胞，虽然后来证明那些并不是细胞贴壁生长…囧……七、创新实验初期1、创新本组认为，依靠本科生实验室的条件和我们的自身实力所能做到的创新实验大致上可以分为几类：①对于既有实验方法的改进（如搅拌溶解改为超声溶解等）②对实验原理的优化（如合成阿司匹林时反应路线的调整）③对现有高新技术的重现（如质粒DNA的提取等）2、思考过程怎样制造创新点→回想组织块培养并未成功，希望可以完善→本次实验培养的细胞比较混杂，希望可以提纯→提纯后想要发挥纯化细胞的作用，进行细胞合成制成单克隆抗体→从培养普通细胞发展到特殊细胞，如癌细胞→癌细胞很好养，既然要研究癌细胞主要是研究杀灭癌细胞的有效药→养过二倍体后尝试单倍体3、创新内容因此，我组从中选取了两项进行实验创新，即①原理优化：组织块培养法的优化②高新技术细胞的无限稀释克隆细胞融合癌细。