大鼠慢性脑低灌注模型再灌注脑组织HIF-1α-VEGF表达意义.doc

大鼠慢性脑低灌注模型再灌注脑组织HIF-1 a WEGF表达意义【摘要】目的 观察缺氧诱导因子Ta (HIF-1 a )和血 管内皮生长因子(VEGF)在大鼠慢性脑低灌注后再灌注脑组 织中表达的意义方法SPF级雄性SD大鼠24只，随机分为 两组，假手术组(S组)和再灌注组(R组)，每组12只 建立大鼠慢性脑缺血模型，6周后恢复血流灌注，于再灌注 前即刻(R0)、再灌注 1 h (R1). 24 h (R2)及 72 h (R3) 行激光多普勒血流探测仪(LDPI),检测脑皮层血流灌注量; 其后采用 qRT-PCR 法，检测 HIF-1 a -mRNA、VEGF-mRNA 在脑 组织中的表达结果大鼠慢性脑缺血再灌注后lh,实验侧 脑皮层血流灌注量较对侧下降(73. 1226. 75) %,再灌注 后24 h脑皮层血流灌注量有所恢复，72 h仍未达到基线水 平；与S组比较，各组大鼠再灌注后的不同时点 HIF-la-mRNA、VEGF-mRNA均表达增高(P25%,提示产生明 显的盗血效应，即缺血成功缺血6周后，腹腔注射10%水 合氯醛1 ml/kg,麻醉下恢复血流灌注，采用可控性保温垫 维持直肠温37 C,维持实验室温度24 C〜25 C,湿度60%。

1.2脑皮层血流灌注量检测 将麻醉后的大鼠固定于脑 立体定位仪上开颅，颅骨窗位于冠状缝和人字缝之间，大小 约5 mmX6 iniiio于再灌注前即刻(R0)为基础状态、再灌注1 h (R1)、24 h (R2)及72 h (R3)时点，各组随机取6只 大鼠，采用PeriScan PIM 3激光多普勒血流灌注成像仪(Perimed公司，瑞典),以低功率激光束连续扫描已暴露的脑窗皮层测量区域和矢状缝中点左右方各1.5 mm点LDPI 激光波长为670 nm,采用NR扫描模式，步长3 mm,扫描头 髙度在15〜30 cm,扫描面积4 cmX4 cm,记录扫描到的面 积血流灌注量和目标点血流灌注量测量数值单位为PU(Perfusion Unit),其值越大代表皮层血流及灌注越强检测数据及图像直接储存在电脑硬盘，应用LDPI win 3. 1软件分析，处理结果导入Excel 2000用于对比分析［5,6］1. 3 荧光 RT-PCR 检测 HIF-1 a、VEGF-mRNA 表达 取各 组大鼠右侧半球额顶区皮质，约1 mmX 1 mmX2 mm大小 按Trizol试剂说明提取组织总RNA；使用逆转录试剂盒（Promega公司），按操作说明合成cDNA；以cDNA为模板进 行 PCR 扩增 o HIF-1 a 引物：上游 5，tatctgaaagccctggatgg 3?,下游 5’ tgggccatttctgtgtgtaa 3" ； VEGF 引物： 上游 5’ gccca tgaag tggt gaag tt 3" , 下游 5’actccagggct teat tat tg 3" ORT-PCR操作按试剂盒说明进行。

PCR 条件：95 C 1 min, 60 C 1. 5 min, 72 C 3 min, 40 个循环后，72延伸15 mine PCR产物以荧光TaqMan的方 法检测，将40个循环所测得基线水平荧光强度的标准偏差 的10倍设为CT值(cycle threshold,即每个反应管内的 荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，应用比较Ct 法进行相对定量在RT-PCR的条件下，经过内标基因的均 一化处理后，推导出目标基因的相对定量为2-A A Ct,即目 标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样 本的倍数来表示1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析 计量资料用均数土标准差(x土s)表示，组间比较t检验， P0. 05)； R1组可见到实验侧大脑皮层灌注量较对侧下降约 (73. 1226・75) %,差异有统计学意义(P0. 05)；而R3组 的实验侧相比对侧血流下降比率仍为(74. 4627. 68) %, 差异有统计学意义(P[2 ] Matsuda T , Abe T , Wu JL , etal. Hypoxia—inducibleangiogenesis in a ratfactor-1 alpha DNA induced cerebral ischemia mode1.Neurol Res, 2005, 27 (5) :503-508.[3] Zhang ZG, Zhang L, Jing Q, et al. VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain I. J Clin Invest, 2000, 106： 8~29.[4] Yassari R, Sayama T, Jahromi BS, et al. Angiographic , hemodynamic and histological characterization of an arteriovenous fistula in rats. Acta Neuroch让(Wien), 2004, 146 (5) :495-504.[5] Kimme P, Ledin T, Sjberg F. Cortical bloodflow autoregulation revisited using laser Doppler perfusion imaging .Acta Physiol Scand , 2002 , 176(4) :255-262.[6] 江楠，李雪松，荣健，等.亚低温对大鼠慢性脑 缺血再灌注后脑皮层血流灌注量的影响.广东医学，2009, 30 (11) ： 1616-1618.[7] Michelson GB, Chang SD, Stapf C, et al. The epidemiology of brain arteriovenous ma1formations. Neurosurgery, 2000, 47:389-396.[8 ] Choi JH, Mohr JP. Brain arteriovenous malformations in aduIts. Lancet Neurol , 2005 , 4(5) :299-308・[9] AL~Shahi R, War 1 ow C. A systematic review of the frequency and prognosis of arteriovenous ma1formations of the brain in aduIts. Brain, 2001, 124：1900-1926.[10] Rothbart D, Awad A, Lee J, et aL Expression of angiogenic factors and struetural proteins in central nervous system vascularma1formations.Neurosurgery, 1996, 38： 915-925.（收稿日期：2011-09-13）（本文编辑：车艳）。